本发明涉及病原菌检测技术领域,尤其涉及一种检测小麦叶锈菌的试剂盒及鉴别方法。该试剂盒中包括5条等温扩增引物,其序列如SEQ ID NO.1~5所示。该5条引物以人为选定的小麦叶锈菌特异性序列(如SEQ ID NO.6)为基础而设计得到,含有小麦叶锈菌DNA片段的待测物能够利用上述引物进行大量扩增,所得的扩增产物可以与荧光染料发生颜色变化,而不含小麦叶锈菌DNA片段的待测物则不会产生任何扩增,不与荧光染料发生颜色变化,从而能够快速鉴别待测物中是否含有小麦叶锈菌DNA,且其他病原菌对该结果无干扰,检测灵敏度高、特异性好、检测率高。