本发明公开一种CHO细胞内源性冷诱导RNA‑结合蛋白启动子核心序列及其应用。该核心序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过生物信息学方法分析了CIRP基因翻译起始位点上游1500bp的DNA序列,选择置信度较高的基因片区作为假想启动子;设计引物,从CHO细胞基因组中分别克隆获得目标基因序列,再亚克隆入适合的载体中使其驱动目的基因在CHO细胞中表达,比较在37℃和32℃温度条件下不同启动子的活性,获得最优启动子序列,分析其元件组成,获得核心序列。具有该核心序列的启动子在亚生理低温条件下培养48小时后表达强度分别为CMV启动子的0.8倍和1.2倍,是37℃条件下表达强度的4.5倍和4.6倍。
本发明公开了一种人工设计的青霉素G酰化酶原及编码序列和发酵方法。该青霉素G酰化酶原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α亚基和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β亚基。该酶原可以加工为成熟的青霉素G酰化酶,可用于阿莫西林等β-内酰胺类抗生素的合成。编码该酶原的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,该核苷酸序列为经过优化得到,适于大肠杆菌中进行表达。将该核苷酸序列重组于大肠杆菌表达载体上,再转化到大肠杆菌表达菌株中,使用由有机氮源、碳源和无机盐组成的发酵培养基,配合补料培养基进行发酵。通过该发酵方法得到的青霉素G酰化酶的酶活,对于组成型表达菌株能达到28000U/L,对于诱导型表达菌株能达到35000U/L。