本发明提供了一种耐碱性7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)以及利用该耐碱性7β‑HSDH酶进行制备高纯度熊去氧胆酸的方法,属于生物技术领域。所述耐碱性7β‑HSDH酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示氨基酸序列相比,在SEQ ID No.1所述序列的第228位丝氨酸存在突变,所述第228位丝氨酸突变为苯丙氨酸或缬氨酸,所述方法包括利用该耐碱性7β‑HSDH酶制备熊去氧胆酸的步骤。本申请提供的耐碱性酶以及利用该耐碱性酶制备熊去氧胆酸的方法,能够显著提高从原料7K‑LCA转化为熊去氧胆酸的转化率,并且产品纯度高,符合药典的要求,即该方法能够低污染、可持续、易工业化的获得高质量的熊去氧胆酸。