本发明公开了一种基于DNA条形码鉴别齿小蠹属昆虫的特异性引物、试剂盒及方法,属于分子生物学技术领域。试剂盒中包括特异性引物、DNA条形码序列。DNA条形码包括美云杉齿小蠹条形码、白云杉齿小蠹条形码、平额重齿小蠹条形码和大云齿小蠹条形码;序列如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.11所示;特异性引物序列为:J2246:5'‑GCTTTTGGAGTYYTAGG‑3';N2723:5'‑GAAWGTTAAATTTACTC‑3'。将其应用于鉴定云杉属植物上携带的齿小蠹属昆虫,能够弥补形态鉴定的缺陷,不受害虫虫态的限制,快速、准确地鉴定植物检疫截获的齿小蠹属昆虫。