本发明公开了一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI及其应用,涉及植物基因工程技术领域,其技术要点为:所述烟草小G蛋白调控因子为基因RhoGDI,所述基因RhoGDI来自普通烟NC89,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述基因RhoGDI编码的蛋白质RhoGDI的氨基酸序列见SEQ ID NO:2所示。所述基因RhoGDI与烟草花叶病毒(TMV)感病相关基因NtRHO1相互作用,调控TMV感病相关基因NtRHO1表达,从而在烟草抗TMV中应用。本发明克服了现有技术中采用化学农药对其防治毒性较大、易残留污染环境、对人畜有害,持续地使用还会使植物产生抗药性的问题,将本发明方案应用于烟草病毒防治,对于可持续发展及环境安全有着重要的意义。