本发明属于基因工程和生物催化领域，具体公开了一种耐热α‑L‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用；所述α‑L‑鼠李糖苷酶为如（a）或（b）所述的蛋白质：（a）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有α‑L‑鼠李糖苷酶活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明提供了一种新型热稳定性较强且能高效切除芦丁α‑1,6鼠李糖苷键的α‑L‑鼠李糖苷酶，能够长时间耐受高温，热稳定性优异，对芦丁有较高的水解效率，摩尔转化率高达99.5%，并且公开了上述酶转化芦丁为异槲皮素的最佳反应条件。
