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[发明专利]一种敞开式TBM前置式超前管棚施工方法-CN202110710340.3有效
发明人：郑传赞;齐梦学;曾绍毅;杨国清;刘晓春;张全洲;李晓伟;祖尧;段朋伸;谢志强 -专利权人：中铁十八局集团有限公司;中铁十八局集团隧道工程有限公司
申请日： 2021-06-25 - 公布日： 2023-03-24 - 主分类号： E21D9/04 文献下载
摘要：本发明公开了一种敞开式TBM前置式超前管棚施工方法，所述步骤包括如下步骤：1）施作中空锚杆进行注浆，加固护盾及刀盘区域边顶拱；2）进行导向孔施工；3）打设超前管棚；4）通过注浆回填管棚与导向孔之间的间隙；5）安装排气管及止浆塞；6）对管棚进行注浆。本发明具有施工便捷、工艺简单、成本低廉的优点，采用本方法最大程度上保证了管棚成功、管棚有效覆盖范围、管棚注浆效果，能够使的TBM快速、安全通过断层破碎带，有效解决卡机问题，提高了施工效率，降低了施工成本。
一种敞开 tbm 前置超前施工方法

[发明专利]高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用-CN202210758278.X在审
发明人：祖尧;王宏杰 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-09-20 - 主分类号： C12N15/89 文献下载
摘要：本发明公开了高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用，在基因簇中确定基因删除的靶点序列，设计特异性CRISPR gRNA靶点序列和扩增引物，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，纯化，体外转录，gRNA与Cas9蛋白显微注射并提取基因组进行PCR扩增，依次经过T7E1酶切和琼脂糖凝胶电泳得到的胶图检测条带灰度值，得到每个条带的亮度体积计算敲除效率，组成最优靶点组合进行显微注射并提取基因组，经过双外侧引物PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，稳定培养即得。本发明首次采用CRISPR单位点敲除效率评估，筛选CRISPR靶点组合产生高效的基因组大片段删除，可用于脊椎动物的基因组中基因大片段的高效删除。
高效构建基因组片段删除突变体方法应用

[发明专利]斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法和应用-CN202210758285.X在审
发明人：祖尧;王冰琦 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-09-20 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的制备方法和应用，包括：确定hoxbb基因簇的敲除靶点分别位于hoxb1b基因的第1个外显子上和hoxb8b基因的第1个外显子上设计gRNA序列，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化、体外转录获得gRNA，将hoxb1b和hoxb8b的gRNA与Cas9mRNA混合共同注射导入斑马鱼受精卵中，培养获得稳定遗传的hoxbb基因簇缺失突变体。本发明通过基因组上多个连续基因共同敲除并获得稳定突变体提供方式方法，同时斑马鱼hoxbb基因簇缺失突变体的表型为研究hoxbb基因簇的生物学功能及与hoxbb基因簇缺失相关的疾病奠定基础。
斑马 hoxbb 基因缺失突变体制备方法应用

[发明专利]微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用-CN202210760655.3在审
发明人：祖尧;武秀知;杨小静;王宏杰 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-09-13 - 主分类号： C12N15/89 文献下载
摘要：本发明公开了微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用，利用CRISPR技术敲除基因组微卫星重复序列NGGN，包括设计gRNA位点‑PCR‑纯化‑体外转录和纯化‑显微注射‑产生表型‑胚胎死亡‑表型分析的步骤。本发明首次利用CRISPR系统设计针对微卫星重复序列NGGN新的gRNA靶点，通过敲除或结合微卫星重复序列NGGN对斑马鱼基因组中包含微卫星NGGN的重复序列产生作用，产生胚胎爆裂表型，同时发现不同切割效果的Cas9蛋白与sgRNA共注射斑马鱼胚胎都能产生表型。该重复序列突变体的细胞骨架异常且P53信号通路受到影响，可作为动物模型用于研究微卫星在基因组中功能和其与疾病关系。
卫星重复序列突变体构建方法应用

[发明专利]一种敞开式TBM扩挖防栽头方法-CN202110672432.7有效
发明人：李晓伟;齐梦学;郑传赞;曾绍毅;杨国清;刘晓春;张全洲;黄勇;伍金军;祖尧 -专利权人：中铁十八局集团有限公司;中铁十八局集团隧道工程有限公司
申请日： 2021-06-17 - 公布日： 2022-09-13 - 主分类号： E21D9/087 文献下载
摘要：本发明公开了一种敞开式TBM扩挖防栽头方法，包括如下步骤：1）扩挖掘进；2）清理底护盾后方区域拱底积渣；3）刀盘后退；4）将弧形钢板对齐后放置在底护盾后方；5）在主梁下方放置顶升装置；6）放置千斤顶至弧形钢板与顶升装置之间；7）启动顶升装置，抬高刀盘及底护盾2；8）利用千斤顶将弧形钢板顶入底护盾下方；9）移除千斤顶（9），拆除顶升装置。本发明具有的结构简单、施工操作方便、施工周期短、成本低廉的优点，采用它不但保持了TBM开挖轴线，避免了TBM扩挖期间栽头掘进，保证了开挖轴线，而且减少了TBM主司机调向难度，提高了施工质量，同时，还延缓了由于频繁大幅度调向造成的TBM机械结构的疲劳，提高了设备完好率。
一种敞开 tbm 扩挖防栽头方法

[发明专利]kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法和应用-CN202210760659.1在审
发明人：祖尧;芮宇梦;赵霞 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-08-23 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼系的构建方法和应用，利用CRISPR技术在tbx5a基因的第一个外显子设计gRNA序列，和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼kctd10基因自发突变体的单细胞期胚胎中，通过鉴定、筛选和培养获得稳定遗传的kctd10和tbx5a基因双突变体斑马鱼。tbx5a基因突变体表现出类似人类心手综合征的心脏畸形等症状，而kctd10和tbx5a双突变体斑马鱼部分缓解心脏环化异常的表型，同时挽救房室间隔标记基因的异位表达，本发明的双突变体模型可作为心手综合症的致病机理和治疗心手综合征的小分子药物筛选的动物模型。
kctd10 tbx5a 基因突变体斑马构建方法应用

[发明专利]斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用-CN202210760738.2在审
发明人：祖尧;王冰琦 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-08-23 - 主分类号： C12N15/89 文献下载
摘要：本发明公开了斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用，包括确定斑马鱼hoxbb基因簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因的靶点位置并分别设计靶点gRNA序列和引物进行PCR扩增，体外转录获得gRNA与Cas9mRNA显微注射到斑马鱼中，有突变的斑马鱼与野生型杂交得杂合子F1，性成熟的F1交配得纯合突变体，对基因敲除的后代显微成像和单基因鉴定初步筛选具有明显表型的基因hoxb1b，单细胞测序数据分析hoxbb中四个单基因早期表达情况和原位杂交、基因敲低与过表达筛选出与心脏早期发育相关的主效基因hoxb1b，有助于寻找致病靶点和药物筛选。
斑马心脏发育相关基因缺失突变体中主效筛选方法应用

[发明专利]hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用-CN202210760745.2在审
发明人：祖尧;武秀知;贺经纬 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-08-23 - 主分类号： A01K67/027 文献下载
摘要：本发明公开了hoxaa基因簇缺失斑马鱼突变体的制备方法和应用，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤。本发明首次运用CRISPR技术删除基因组中hoxaa基因簇长片段构建hoxaa基因簇缺失的斑马鱼突变体，其可用于与hoxaa基因簇相关疾病的动物模型研究hoxa基因在动物体生长发育的调节机制和基因缺失引起的相关疾病治疗。
hoxaa 基因缺失斑马突变体制备方法应用

[发明专利]hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体的构建方法和应用-CN202210760760.7在审
发明人：祖尧;贺经纬 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-08-23 - 主分类号： C12N15/873 文献下载
摘要：本发明公开了hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体的构建方法和应用，通过CRISPR技术构建，依次包括设计gRNA位点—PCR扩增—gRNA的模板纯化—体外转录—gRNA纯化—显微注射—检测敲除效率—饲养至成鱼—与野生型交配—检测下一代胚胎是否携带突变位点—饲养成年后剪尾鉴定出杂合突变体—两杂合体交配得到纯合突变体的步骤。本发明首次利用CRISPR技术构建hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体，其可作为动物模型用于研究hoxa1a基因在心脏发育过程中的作用以及为治疗Bosley‑Salih‑Alomainy综合征提供基础。
hoxa1a 基因斑马突变体构建方法应用

[发明专利]斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用-CN202210760774.9在审
发明人：祖尧;何宏阳;胡沛男 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-08-23 - 主分类号： C12N15/89 文献下载
摘要：本发明公开了斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用，包括：确定hoxba基因簇的敲除靶点分别位于hoxb13a基因的第1个外显子上和hoxb1a基因的第1个外显子上设计gRNA序列，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化、体外转录获得gRNA，将hoxb13a和hoxb1a的gRNA与Cas9蛋白混合共同导入到斑马鱼中，培养获得稳定遗传的hoxba基因簇缺失突变体。本发明为基因组上多个连续基因共同敲除并获得稳定突变体提供方式方法，同时该突变体的表型为研究hoxba基因簇的生物学功能及与hoxba基因簇缺失相关的疾病奠定基础。
斑马 hoxba 基因缺失突变体制备方法应用

[发明专利]斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用-CN202210758271.8在审
发明人：祖尧;胡沛男;何宏阳 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2022-06-30 - 公布日： 2022-08-16 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用，包括：确定hoxb1a基因的敲除靶点位于hoxb1a基因的第1个外显子上设计gRNA序列，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，纯化，体外转录获得gRNA，将hoxb1a的gRNA与Cas9蛋白混合共同导入斑马鱼的单细胞期胚胎中，培养获得稳定遗传的hoxb1a基因缺失突变体。本发明首次利用CRISPR技术在斑马鱼基因组上进行hoxb1a基因敲除，实现斑马鱼中hoxb1a基因的特异敲除，可作为动物模型用于研究hoxb1a基因的生物学功能和与hoxb1a基因缺失相关的疾病。
斑马 hoxb1a 基因缺失突变体制备方法应用

[发明专利]斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法-CN201910090967.6有效
发明人：任建峰;黄姣;霍锦倩;刘姣;祖尧;李伟明 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2019-01-30 - 公布日： 2022-05-24 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法，包括以下步骤：选择斑马鱼gys1基因序列的第四个外显子序列设计gys1基因敲除的靶点，gys2基因序列的第三个外显子序列设计gys2基因敲除的靶点，根据上述靶点序列设计扩增引物，以pUC19‑scaffold plasmid为模板进行PCR扩增，经纯化和体外转录获得gys1和gys2基因敲除靶点gRNA，再将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼受精卵中，获得稳定遗传的斑马鱼gys1和gys2基因纯合突变体。斑马鱼产卵量大，繁殖周期短，胚体透明，有助于进一步研究人类糖原贮积症的发病进程及详细机制。
斑马糖原贮积症 gys1 gys2 基因突变体构建方法

[实用新型]一种敞开式TBM分体式钢枕-CN202121363253.7有效
发明人：李晓伟;郑传赞;刘晓春;张全洲;沈朝兵;黄勇;伍金军;祖尧;聂虎;谢志强 -专利权人：中铁十八局集团有限公司;中铁十八局集团隧道工程有限公司
申请日： 2021-06-19 - 公布日： 2021-12-03 - 主分类号： E01B23/12 文献下载
摘要：本实用新型公开了一种一种敞开式TBM分体式钢枕，包括中枕组件，中枕组件两侧分别设置有边枕组件，所述边枕组件与中枕组件可拆卸连接；本实用新型通过将中枕组件和边枕组件可拆卸连接，使钢枕可以循环利用，减少了占有空间，避免了钢枕材料浪费，降低了钢枕铺设材料的成本，同时，通过在各支撑腿底部均对应设置有支撑板，增大了各支撑腿与隧道拱底接触面积，防止轨枕下沉。
一种敞开 tbm 体式

[发明专利]ddx27基因缺失斑马鱼突变体的制备方法-CN201810525964.6有效
发明人：张庆华;时灿;岳倩文;祖尧;李伟明 -专利权人：上海海洋大学
申请日： 2018-05-28 - 公布日： 2021-11-23 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明公开了一种斑马鱼ddx27基因缺失突变体的制备方法；包括如下步骤：确定ddx27基因敲除的靶点在斑马鱼ddx27基因第6个外显子上，设计gRNA序列；以pUC19‑‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑ddx27‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；PCR产物纯化、体外转录获得gRNA；将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中，培养获得稳定遗传的ddx27基因突变体。另外，本发明还公开了ddx27基因缺失斑马鱼突变体的表型，对于研究其生物学功能有重要作用。
ddx27 基因缺失斑马突变体制备方法

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