本发明涉及病毒检测技术领域,具体涉及用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。本发明提供用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的分别或同时实时荧光定量RT‑PCR检测的引物探针组合,其含有三对特异性引物和三条特异性探针,其中,所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示,所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。本发明提供的引物探针组合和检测方法具有较高的特异性和灵敏性,可重复性好,检测简便、快速具有实际应用价值。在新的人兽共患病不断出现的形势下,本发明在疾病的早发现、早诊断方面尤显重要意义。