本发明公开了一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法,该试剂盒包括:转录及扩增引物、2.5x Reaction MIX、DEPC水、热启动tap酶和逆转录酶,其中,转录及扩增引物包括17种RNA病毒、2种DNA病毒及4种呼吸道致病菌共23种呼吸道病原体的引物序列,基因序列如SEQ ID NO.1~NO.44所示,病原体样本提取之后,经试剂盒单管反应,完成转录及扩增,经毛细管电泳检测,结果经软件分析确定病原体类别。本技术方案的优点是特异性强、灵敏度高、检测速度快、单管完成转录扩增,操作简便。