本发明涉及生物技术领域,提供了一种逆行跨多级突触的标记方法及其应用。逆行跨多级突触标记的方法包括以下步骤:S1:构建表达N2cG的腺相关病毒核心质粒,并利用所述腺相关病毒核心质粒制备可跨血脑屏障的重组PHP.eB血清型腺相关病毒;S2:将所述重组PHP.eB型腺相关病毒经尾静脉注射到小鼠活体;S3:注射3周后,再注射CVS‑N2c‑ΔG‑EGFP病毒,其中,所述腺相关病毒核心质粒的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明提供的逆行跨多级突触标记的方法可有效标记全脑多级输入网络,在特定脑区的多级神经输入结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗评估等方面具有广泛的应用价值和市场前景。