本发明涉及利用EST-SSR标记鉴定中药溪黄草的品种的方法,包括以下步骤:(1)提取待测样品基因组的DNA;(2)以步骤(1)提取的DNA为模版,用基于溪黄草转录组序列的EST-SSR核心引物组进行PCR扩增;(3)对扩增产物进行测序分型;所述EST-SSR核心引物组包括24对引物中的至少10对,每对引物由上游引物和下游引物组成,其核苷酸序列为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.48。该方法能够对常见溪黄草的药材基源品种及混伪品进行有效、快速的鉴定,结果准确、可靠,该鉴定方法简单易行,时效性高,适用于市场及生产上溪黄草药材的种质鉴定及品种保护。