本发明提供了一种棉花隐性核不育恢复基因GhNSP及其应用和创制棉花雄性不育种质的方法，属于棉花育种技术领域。所述棉花隐性核不育恢复基因GhNSP为以下核苷酸序列中的一种：1)序列表SEQ ID NO：1中所示的DNA序列；2)编码序列表SEQ ID NO：2所示蛋白质的DNA序列。本发明还提供了一种敲除所述棉花隐性核不育恢复基因GhNSP的试剂在棉花细胞核雄性不育系中的应用。此外，本发明还提供了一种创制棉花雄性不育种质的方法，采用所述sgRNA或CRISPR/Cas9系统敲除陆地棉中基因GhNSP，创制出陆地棉新的不育系材料，对杂种优势利用和群体改良具有非常重要的意义。
本发明属于作物分子育种领域，具体涉及GhAOC4基因敲除创造棉花雄性不育和保持两用系的方法。特征为，分离一种棉花雄性不育性状相关的基因片段SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，和作为分子标记应用的sgRNA1‑guidRNA、sgRNA2‑guidRNA序列，通过与CRISPR/Cas9系统和分子检测后得到棉花雄性不育系。所述的基因通过转基因后的表达被扰乱后，引起常温下棉花雄性不育。通过遗传转化获得棉花基因编辑突变体，早期的花蕾喷施5×10‑4mol/L的茉莉酸甲酯溶液，可恢复突变体的雄性不育表型，通过自交扩繁，得到包含突变体基因的具有雄性不育和保持特征的两用系材料。
本发明涉及超表达GhCBL2基因在促进棉花叶片中可溶性糖积累的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhCBL2基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GhCBL2蛋白在促进棉花叶片中可溶性糖积累的应用。将棉花中克隆的GhCBL2基因构建到超表达载体pKGWFS7.0上，借助农杆菌介导的遗传转化，使棉花叶片可溶性糖含量显著提升，从而提高棉花对非生物逆境的抗性，可以为培育节水高产棉花新品种提供理想的途径。
本发明提供了棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用。本发明以细胞质雄性不育系6001A和恢复系7R13两个材料及其衍生群体为基础，将恢复基因进行了遗传定位，所述棉花恢复系恢复基因的分子标记由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物经PCR扩增棉花基因组DNA得到。本发明中的分子标记可以快速、准确地鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系以及棉花恢复系种子纯度。
本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体进行改造，以BeYDV双生病毒中复制子元件为载体，将sgRNA序列构建在复制环内，构建了在棉花中具有基因编辑功能的载体BeYDV‑Cas9，选取GhCLA为目标基因验证BeYDV‑Cas9在棉花中的应用，并且设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将BeYDV‑Cas9基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率类型，从而有效的解决了传统的CRISPR‑Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。
