本发明公开了一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物及其应用;所述引物包括正向引物和反向引物;所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。本发明制备得到的引物通过设计改造和反应体系优化,极大提高了检测特异性,解决了非探针的嵌合染料实时荧光PCR技术的方法学缺陷问题。本发明检测保加利亚乳杆菌噬菌体的方法操作简便、快速,检测特异性强、灵敏度高,结果稳定可靠、成本低廉,适合于酸奶发酵工业中对各种原料奶、发酵中的产品和环境样品的检测,有利于快速检出噬菌体污染情况并采取有效及时的防治措施。