本发明公开了一种乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针,是根据乙脑病毒E基因保守区域的保守区域设计的,用以定量检测样本中乙脑病毒的核酸拷贝数。具体来讲,所述引物的上游引物具有序列表中SEQ IDNO:1的核苷酸序列,下游引物具有序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列;所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列。本发明对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有具有较大的实际意义,能够保证相关生物制品的质量,控制乙脑病毒传播和人民用药安全。本发明的检测方法及试剂盒可用于临床病人脑脊液样品和小型猪脑组织样品及生物制品的乙脑病毒检定,应用前景广阔。