[发明专利]一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组纽布病毒疫苗

说明书

本发明提供一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组纽布病毒疫苗，以E1、E3基因联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，构建出能够表达NeV VP1蛋白的重组腺病毒，并以小鼠为模型评价重组腺病毒诱导的特异性免疫反应。本发明提供的疫苗对纽布病毒具有良好的免疫保护效果，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，且该疫苗制备方法快速简便，可在短期内实现大规模生产并用于预防纽布病毒病。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组纽布病毒疫苗。

背景技术

纽布病毒病是由纽布病毒引起的犊牛严重腹泻、厌食、木糖吸收不良及肠道病变(十二指肠和空肠最为严重)等胃肠道疾病。纽布病毒(Nebovirus，NeV)是杯状病毒科(Caliciviridae)纽布病毒属(Nebovirus)的唯一成员，为无囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约为7.4kb，由2个开放阅读框组成，是致犊牛腹泻的重要病原，也是国内致牛腹泻的新发病毒。目前为止，NeV已在英国、美国等12个国家以及我国的四川、辽宁、内蒙古、西藏等多个省市的奶牛及牦牛体内被检测到，表明NeV已在我国境内广泛分布。VP1是NeV的主要结构蛋白，由ORF1编码，大小为548个aa或549个aa，主要参与受体结合、宿主特异性和免疫原性，能诱导产生中和抗体，在病毒的感染免疫中发挥着重要作用。目前尚无预防和/或治疗纽布病毒的疫苗。

腺病毒(Adenovirus，Ad)常感染呼吸道，可作为载体递送基因，因此可用于基因治疗及疫苗研发。以腺病毒载体进行动物疫苗的研究，其优势在于：(1)病毒粒子相对稳定，安全性较好；(2)腺病毒基因组较大(36Kb)，切除致瘤部分〔如E1、E3)区后，可以插入相当大的外源基因；(3)病毒感染的宿主细胞极为广泛，而且由于它是DNA病毒，不会受其它RNA信息的干扰。不依赖宿主细胞增殖；(4)腺病毒载体很容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；(5)重组腺病毒的靶细胞是分裂或者不分裂的细胞，且含有目的基因的重组腺病毒DNA是游离于细胞基因组外的(不整合入宿主基因组)，目的蛋白可得到瞬时的高水平表达。利用重组腺病毒构建的疫苗可表达保护性抗原，从而诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫反应，复制缺陷型腺病毒载体保留其完整的结构及感染力，使自我复制功能丧失，因此制成疫苗安全性好，已经成为生物学、医学研究方面常用的工具。若能以人复制缺陷腺病毒为载体制备成重组纽布病毒疫苗，对今后纽布病毒的防治具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组纽布病毒疫苗，该疫苗免疫动物后能够诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，具有良好的免疫保护效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种编码纽布病毒VP1蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种含有前述多核苷酸的载体。

在一个优选的实施方案中，所述载体为pDC316。

第三方面，本发明提供一种表达前述多核苷酸的人复制缺陷重组腺病毒。

本发明以E1、E3基因联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体制备疫苗，由于E1和E3区编码多种与对抗机体免疫防卫有关的蛋白质，联合缺失这两个区域的重组病毒疫苗能更有效地刺激免疫应答，并成功地克服在新生动物中可能存在的来自于母体的免疫干扰。

在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒来源于AdMax腺病毒系统。