[发明专利]用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：向蜜蜂大脑组织中加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；所述蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，收集大脑组织混合物滤液；将所述大脑组织混合物离心后，获得沉淀物，将所述沉淀物重悬后，离心，获得的沉淀用缓冲液重悬，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。本发明的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，第一次将蜜蜂大脑单细胞进行分离，分离的单细胞纯度高，活性强，杂质碎片少，分离获得的蜜蜂大脑单细胞用于单细胞测序具有很好的效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法。

背景技术

蜜蜂不仅作为重要的农业昆虫在世界范围被广泛饲养，其独特的生殖现象和复杂的社会性行为也使得蜜蜂成为优秀的昆虫研究模型。意大利蜜蜂(Apis mellifera)作为社会性昆虫，在具备昆虫特征的同时，还具有明显的群体生物学的行为特点，对于人类的学习记忆能力和社会行为的研究是极为重要的模型。蜜蜂是农业网络中的关键物种，表现出极强的发育可塑性，具体体现在级型分化和社会分工的调控方面。虽然蜜蜂的遗传学操作(如基因编辑、遗传学杂交等)存在诸多困难，至今仍难以实现类似于果蝇中大规模筛选突变体的实验，但这并不影响蜜蜂逐渐成为表观遗传学和行为学研究的热点。

蜜蜂拥有体积仅约为1立方毫米的大脑，尽管大脑体积小，但在处理复杂的环境信息和调控丰富的行为能力上发挥了决定性作用。与其他昆虫一样，蜜蜂的脑组织可划分为前脑、中脑和后脑三部分。在蜜蜂中，前脑是大脑中最重要的也是所占体积最大的部分，由蕈形体(又称蘑菇体)、中心复合体、视叶和侧前脑等多种重要感觉结构组成，其中蕈形体是负责学习与记忆的高级中枢，处理来自初级中枢的各种感觉刺激。

尽管蜜蜂的大脑体积小，但少量的大脑神经细胞控制着大量的复杂行为。随着生物遗传学的发展，使人们可以从分子水平上了解蜜蜂学习记忆的机制，而对蜜蜂学习记忆相关基因及功能的研究即为一种有效的手段，对于明确其学习记忆的分子机制具有重要作用。

综上，如何获取蜜蜂的大脑组织的单细胞悬液，有助于提供从分子角度去研究蜜蜂的记忆机制以及相关生物学行为。

发明内容

为此，本发明提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，所述方法包括以下步骤：

向蜜蜂大脑组织中加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；

所述蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，收集大脑组织混合物滤液；

将所述大脑组织混合物离心后，获得沉淀物，将所述沉淀物重悬后，离心，获得的沉淀用缓冲液重悬，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；

其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。

本发明的一个实施例中，所述蛋白酶溶液中，liberse TM酶的浓度为12-14U/ml。

本发明的一个实施例中，所述蛋白酶溶液中，木瓜酶的浓度为3-5mg/ml。

本发明的一个实施例中，所述重悬液为含质量百分数为9-11％％FBS的DMEM培养基。

本发明的一个实施例中，所述过滤采用40μm细胞筛过滤。

本发明的一个实施例中，所述大脑组织混合物离心条件为：4℃，300RCF，离心10min。

本发明的一个实施例中，所述蜜蜂大脑组织的分解条件为37℃水浴，10-30min，冷却至室温，同时上下颠倒蜜蜂大脑组织混合物。