[发明专利]一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法及其应用。本发明的构建方法包括如下步骤：本实验选取分娩后1天的C57/BL6母鼠作为实验对象，将母鼠分为空白对照组(NT)和乳腺纤维化模型组(TGF‑β1)，每组的样本量包含5只母鼠。腹腔注射戊巴比妥钠将小鼠麻醉并保定，以乳导管灌注的方法对第四对乳头注射TGF‑β1，注射浓度为100ng/mL，注射频率为和次数分别为，每两天注射一次共四次，并在最后一次TGF‑β1注射后的24h后收集乳腺样品。本发明构建的模型能够模拟临床上奶牛乳腺纤维化过程中乳腺组织发生的病理变化特点，并且具有良好的可重复性和便捷性，因此该模型具有巨大的实际应用价值。

技术领域

本发明涉及实验动物模型构建领域，具体为一种TGF-β1构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法。

背景介绍

奶牛乳腺纤维化通常由久治不愈的乳腺炎迁延所致，不同的病原菌引起的临床型和隐型乳腺炎均可引起乳腺不同程度的纤维化。纤维化的乳腺导致产奶量明显下降，严重时无奶最终导致奶牛淘汰，给奶牛业造成巨大的经济损失。在乳腺炎症发展早期，成纤维细胞无明显病理变化，但到了急性炎症的后期，由于炎症对乳腺造成持续损伤使组织内稳态无法恢复，多种炎症细胞合成并释放细胞因子，这些细胞因子引起肌成纤维细胞的增生和活泌大量的细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)，ECM的大量积累是所有纤维化病理过程的最主要致病因素，乳腺纤维化过程也同样如此。在研究中常常以Collagen的蛋白水平来衡量ECM的积累程度，

有研究表明活化的肌成纤维细胞有三种来源，分别是50％来源于周围组织的迁移、35％来源于干细胞的分化、15％来源于上皮细胞间充质转化过程(Epithelialmesenchymal transformation，EMT)以上这些过程分都大量分泌ECM。其中在EMT过程中上皮细胞逐渐失去极性并逐渐获得成纤维细胞的一些特性，具体包括α-SMA蛋白和Vimentin蛋白水平的升高，这意味着上皮细胞获得了较强的迁移和分泌能力；E-cadherin蛋白水平的显著降低，这意味着上皮细胞极性受到破坏和紧密连接蛋白水平降低，不利于乳腺屏障的完整性；Collagen蛋白水平显著升高，代表着大量的ECM开始积累，纤维化进程已经开始。

在纤维化的过程中TGF-β1被大量分泌释放，其是促进纤维化病程发生发展的主要刺激因素，其也是促进肌成纤维细胞活化和EMT继承的主要因素。在许多纤维化的研究中常常以TGF-β1诱导的体外模型为基础，筛选候选药物和疾病的深入机制。因此TGF-β1是各种器官中最有效的原发性纤维化诱导剂，并且更是在体外诱导细胞纤维化模型的黄金标准。

奶牛乳腺纤维化已经成为制约规模化奶牛养殖业发展的重要因素之一。然而，由于缺乏标准化实验动物模型，给奶牛乳腺纤维化相关疾病的防控、新型治疗药物和疫苗研发带来巨大的障碍。并且针对乳腺纤维化尚缺乏有效的病理损伤评价模型，血乳屏障的结构特殊性使乳腺纤维化的治疗方案不同于乳腺炎模型。因此，十分有必要构建一种易于操作和标准化的乳腺纤维化模型，为研发奶牛乳腺纤维化新型治疗方案奠定技术基础。因此本研究的目的是构建小鼠乳腺纤维化模型，以期望为临床奶牛乳腺纤维化疾病提供参考。

(一)解决的技术问题

根据目前关于缓解奶牛乳腺纤维化的不足之处，本发明构建了一种小鼠乳腺纤维化模型，以期望为临床奶牛乳腺纤维化疾病提供参考，有利于解决缓解奶牛乳腺纤维化过程中抗生素残留、耐药细菌的产生以及备选缓解药物不足等问题。

(二)技术方案

为达到上述要求，本专利提供以下实验步骤：一种构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法，具体操作如下：

S1、本实验选择8周龄的C57/BL6小鼠进行合笼，每笼1公2母，选取分娩后3至7天的C57/BL6小鼠作为实验对象。实验分为2组，分别是空白对照组(NT)、乳腺纤维化模型组(TGF-β1)，每组5只小鼠。