[发明专利]一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、本实验选择8周龄的C57/BL6小鼠进行合笼，每笼1公2母，选取分娩后1天的C57/BL6小鼠作为实验对象；

S2、将小鼠分为两组分别是，空白对照组(NT)和乳腺纤维化模型组(TGF-β1)，每组5只小鼠；

S3、在构建乳腺纤维化模型的过程中，按照45mg/kg的标准用戊巴比妥钠将小鼠进行麻醉并保定，每隔2天对小鼠的第四对乳区乳导管注射TGF-β1进行乳腺纤维化的模型构建，共4个周期；

S4、在注射TGF-β1第4个周期后进行乳腺组织的取样，一部分乳腺组织用于石蜡切片的制作，观察乳腺组织的病理损伤情况以及纤维化程度，并通过组织免疫荧光染色观察α-SMA蛋白水平的高低；取一部分乳腺组织用于PCR测定，通过IL-6、IL-1β、TNF-α、Collagen 1、MMP1、MMP2、Vimentin基因表达量的高低来反应炎性介质和细胞外基质的分泌情况，用来评估乳腺组织炎症和纤维化的严重程度；取一部分乳腺组织用于Western blot测定，分析Collagen 1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白水平的高低，通过以上全部数据来判断乳腺纤维化模型构建是否成功。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法，其特征在于：每只小鼠按照45mg/kg的比例配制戊巴比妥钠溶液进行麻醉，仰面保定后，将第四对乳区周围进行消毒，剪掉约1mm乳头，两侧乳头均注射50μL浓度为100ng/mL的TGF-β1，共注射4次，周期为每隔2天注射一次，最后一次TGF-β1注射后24h后采取样品并将乳腺样品放在-80℃冰箱保存。

3.根据权利要求1所述的一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法，其特征在于：石蜡切片的制作过程如下：取出新鲜的乳腺组织，用PBS涮洗后，放入4％的甲醛溶液中固定24h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、放入二甲苯中透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色等步骤获取HE染色结果，评估乳腺组织的病理损伤情况；通过Masson染色操作说明书对乳腺组织石蜡切片进行Masson染色，评估乳腺组织纤维化的损伤情况。

4.根据权利要求1所述的一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法，其特征在于：组织免疫荧光的实验步骤如下：石蜡切片经过二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.1％Triton^TM×-100打孔，柠檬酸盐抗原修复，1％PBST封闭，经一抗和二抗孵育，DAPI染色细胞核，封片；最后用荧光显微镜检测实验结果，通过组织免疫荧光染色观察α-SMA蛋白水平的高低。

5.根据权利要求1所述的一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法，其特征在于：PCR的实验步骤如下：在2mL培养皿中加入Trizol试剂，置于室温使其充分裂解，提取总RNA后进行反转录，在八连排管中加入反转录后的cDNA 8μL，2×SYBR Premix 10μL，上下游引物各1μL，震荡摇匀后进行q-RTPCR。

6.根据权利要求1所述的一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法，其特征在于：Westernblot的实验步骤如下：将乳腺组织放入添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，研磨后4℃12000rpm离心10min收集上清；使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白转移到4％SDS-PAGE胶中，75V电泳30min，随后调节电压为110V下电泳60min；电泳后，蛋白质转移到PVDF膜上；用5％的脱脂牛奶封闭2h，一抗Collagen 1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA(1：1000)4℃孵育过夜,洗涤5次，山羊抗鼠或山羊抗兔二抗(1:8000)常温孵育1h，洗涤5次后检测蛋白条带，获取蛋白条带后分析以上全部数据判断小鼠乳腺纤维化模型构建是否成功。