[发明专利]合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种合成聚(3‑羟基丁酸酯‑co‑4‑羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增gadB*、gabT、yqhD三个基因序列；S2：将三个基因序列插入载体中，得到载体质粒；S3：将S2得到的载体质粒转入Halomonas lutescens MDF‑9感受态细胞中。本发明提出了一种新的P34HB的合成途径，在MDF‑9菌株本身具有合成P3HB途径的基础上，再利用基因工程加入一条以使用谷氨酸作为前体化合物合成P4HB的代谢途径，达成生产P34HB的目的。该工程菌能够在PHA领域生产P34HB工艺中有效地降低原料价格，降低毒害风险，提高生产效率。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用。

背景技术

生物聚酯（也称微生物聚酯，或聚羟基脂肪酸酯，Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类重要的非石油基高分子材料，它是利用可再生的天然原料通过微生物发酵而得到的。目前已发现超过百种PHA高分子，它们具有各自的特性，其中聚3-羟基丁酸酯（PHB）是PHA早期最典型的代表，也是最廉价的PHA材料。而近几年出现的3-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸共聚酯（Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate，简称P34HB），是一种崭新的最具前景的PHA高分子材料，其4HB含量在0-100％之间，随着4HB含量的增加，共聚物由半结晶性的硬脆塑料逐渐改变为强度及韧性均大幅提高的塑料，后转变成非结晶富有弹性的弹性体，使得P34HB高分子的性能可以在很大范围内调节，P34HB具有良好的热稳定性，熔点可在130-151℃内改变，分解温度约180℃，加工性较好，可完全生物降解，降解时间随材料中4HB含量和结晶度的高低而变化。P34HB兼具有良好的生物相容性能，生物可分解性和塑料的热加工性能，因此可作为生物医用材料和生物可分解包装材料。由于P34HB是综合性能较为优异的可生物降解高分子材料，国内已有公司开始工业化生产P34HB这种生物聚酯高分子原料，并对其在可降解塑料和生物医学产品方面进行应用开发和推广。

现有技术中制备3-羟基丁酸（P3HB）时需要使用化学催化剂进行酯化反应，酯化反应是需要强酸/高温剧烈条件进行，只能在发酵结束后进行酯化，耗能，成本高，周期长，不易于提取精制，制备的3-羟基丁酸乙酯也容易发生水解，且发酵过程需要灭菌，极大的浪费能源；使用的γ-丁内酯，4羟基丁酸等作为P4HB聚酯的前体化合物因价格昂贵，具有毒性，属于易制毒化学品有很大的局限性，P34HB是3HB和4HB的聚合物，因此目前亟需一种成本低、安全无毒、生产效率高的制备P34HB的方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种新的P34HB的合成途径，在MDF-9菌株本身具有合成P3HB途径的基础上，再利用基因工程加入一条以使用谷氨酸（可生物发酵制取）作为前体化合物合成4HB的代谢途径，达成生产P34HB的目的。

本发明提供一种合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株的构建方法，包括如下步骤：

S1：体外扩增gadB*、gabT、yqhD三个基因序列；

S2：将S1所述的gadB*、gabT、yqhD三个基因序列插入载体中，得到载体质粒；

S3：将S2得到的载体质粒转入Halomonas lutescens MDF-9感受态细胞中；所述Halomonas lutescens MDF-9的保藏编号为GDMCC NO.61850。

进一步的，所述步骤S1中目的基因的扩增体系为：

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进一步的，所述步骤S1中目的基因的扩增程序为：

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