[发明专利]一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于拟南芥叶片组织原生质体单细胞转录组测序的转录抑制剂，其特征在于，所述转录抑制剂由茴香霉素、雷公藤内酯和BMH-21组成；其中，所述转录抑制剂的组成及配方为：15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。

2.一种含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液，其特征在于，所述含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液的组成及配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1%BSA、0.01M CaCl₂、2% 纤维素酶R10、0.4% 离析酶R10、0.5M 甘露醇、1% 果胶酶、15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。

3.一种含转录抑制剂的适用于单细胞转录组测序的拟南芥叶片组织原生质体解离试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液和如权利要求2所述的含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液组成；

所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mM CaCl₂、2mM MES、15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM 雷公藤内酯、5~7μM BMH-21；

所述含转录抑制剂的WI缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15~20μg/mL茴香霉素、5~7.5μM 雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1% BSA、0.01M CaCl₂、2% 纤维素酶R10、0.4% 离析酶R10、0.5M甘露醇、1% 果胶酶、15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。

5.一种利用如权利要求3或4所述的含转录抑制剂的试剂盒酶解拟南芥叶片组织原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤（1）、准备试剂：配制含转录抑制剂的酶解液、含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液；

步骤（2）、制备解离样品：选取拟南芥幼苗茎生叶，剪下洗净、切成碎块；

步骤（3）、组织酶解：向所述步骤（2）中获得的碎片中加入所述的含转录抑制剂的酶解液，静置、混匀、消化酶解；

步骤（4）、消化液浑浊后在显微镜下镜检，估算原生质体得率；

步骤（5）、消化液过筛：先用含转录抑制剂的W5缓冲液润洗组装于离心管上的筛网；然后向所述步骤（4）的消化液中加入所述含转录抑制剂的W5缓冲液，吸取上清过筛；

步骤（6）、原生质体富集：将所述步骤（5）过筛后的滤液离心，富集原生质体；

步骤（7）、原生质体洗涤：向所述步骤（6）富集的原生质体中加入含转录抑制剂的WI缓冲液悬起混匀并离心洗涤，再将洗涤后的原生质体沉淀用适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起，镜检计数。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述拟南芥幼苗茎生叶为20-25天的茎生叶；所述切成的碎块的大小为0.5mm；

和/或，步骤（3）中，所述加入的含转录抑制剂的酶解液的量为5mL；所述静置的温度为37℃；所述静置的时间为15min；所述酶解的温度为37℃；所述酶解的转速为200rpm；所述酶解的时间为30min；

和/或，步骤（5）中，所述润洗筛网的含转录抑制剂的W5缓冲液的量为1mL；

和/或，步骤（6）中，所述离心的温度为25℃；所述离心的转速为100×g；所述离心的时间为7min；

和/或，步骤（7）中，所述离心的温度为25℃；所述离心的转速为200×g；所述离心的时间为6min。

7.如权利要求1所述的转录抑制剂、或如权利要求2所述的含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液、或如权利要求3所述的含转录抑制剂的适用于单细胞转录组测序的拟南芥叶片组织原生质体解离试剂盒在酶解拟南芥叶片组织原生质体单细胞转录组测序中的应用。