[发明专利]一种高效表达MccJ25的工程菌株及其发酵工艺

说明书

本方案提供一种高效表达MccJ25的工程菌株，以解决现有技术中Microcin J25的表达量低的问题。通过下述方法构建而成：分别对mcjABCD进行基因操作，成为一个方向，而且在大肠杆菌中共用一个启动子T7，克隆在载体pBR322，实现了在大肠杆菌的高效表达，表达量为2.4g/L。本方案构建了新的表达载体，分别构建大肠杆菌表达载体和植物乳杆菌表达载体，对MccJ25进行高效表达，同时采用定向进化技术，对MccJ25基因簇进行分子进化，实现了MccJ25的高效表达。在大肠杆菌进行胞外表达和植物乳杆菌进行胞内表达，表达量分别达到为4.1g/L和2.3g/L，达到产业化的水平，为下一步生物兽药和饲料添加剂的应用奠定了基础。

技术领域

本方案属于基因工程技术领域和发酵优化技术领域，具体涉及一种高效表达MccJ25的工程菌株及其发酵工艺。

背景技术

套索肽MccJ25是最早在大肠杆菌Escherichia coli AY25发现的一种细菌素类抗菌肽，分离自人粪便(Blond等，1999)。套索肽MccJ25的合成涉及到4个基因，分别是mcjA、mcjB、mcjC和mcjD(Solbiati等，1996)。

mcjA基因长174bp，为MccJ25前体，加工成熟过程中切除N-末端37aa形成MccJ25。套索肽Mcc J25其中N端的8个氨基酸形成一个圆形的环状结构，9-21氨基酸形成β发夹结构，贯穿圆环。通过生化和核磁共振研究发现，套索肽Mcc J25其中N端的8个氨基酸形成一个圆形的环状结构，9-21氨基酸形成β发夹结构。从结构上通过非共价作用将这个尾部固定住，这个结构称为套索固定的尾部，这个结构能抵御强烈的变性条件，故其性质非常稳定，对温度、蛋白酶、酸碱等有良好耐受性。其对大肠杆菌、沙门氏菌以及志贺氏菌具有很强的杀灭和抑制作用。

目前认为，套索肽MccJ25通过两种方式抑制病原微生物：

1，通过抑制RNA聚合酶活性来干扰细菌mRNA以及蛋白质的合成。

2，通过改变细胞膜的通透性，从而使细菌细胞膜破碎，内容物外渗，病原细菌死亡。

套索肽MccJ25是第一个被发现的索套结构的多肽分子。而索套肽是目前抗菌肽领域研究的一大热点，其抑菌机制与传统的抗生素有所不同，不易产生耐药性，其作为新药开发来对抗细菌感染的潜力巨大。由于MccJ25对大肠杆菌、沙门氏菌等抑菌效果好，故通过基因工程进行改造，获得高产菌株具有重要商业价值。

申请号为CN201610985222.2的专利公开了一种种高效表达Microcin J25(MccJ25)的工程菌株及其发酵工艺，分别将Microcin J25(MccJ25)野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因构建到2个质粒中，转化大肠杆菌MC4100，从而产生出一株高效表达Microcin J25(MccJ25)的工程菌，但表达量只有500mg/mL(即0.5g/L)。

发明内容

本方案提供一种高效表达MccJ25的工程菌株，以解决现有技术中Microcin J25的表达量低的问题。

为了达到上述目的，本方案提供一种高效表达MccJ25的工程菌株，通过下述方法构建而成：分别对mcjABCD进行基因操作，成为一个方向，而且在大肠杆菌中共用一个启动子T7，克隆在载体pBR322，实现了在大肠杆菌的高效表达，表达量为2.4g/L。

进一步，分别采用易错PCR做定向进化，对mcjABCD进行突变，氨基酸序列有所变化，在大肠杆菌中表达，其产物的表达量和抗菌性明显增加，表达量为4.1g/L。

进一步，在杆菌中进行表达，共用一个启动子PslpA，克隆在pLEM415载体中,表达量2.3g/L。

进一步，一种高效表达MccJ25的工程菌株的发酵工艺，包括以下步骤：