[发明专利]一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，包括基础培养基80‑100份、自体血浆5‑15份、诱导剂0.2‑1.5份、活化剂0.2‑1.5份、细胞因子0.08‑0.4份、补充氨基酸2‑8份、葡萄糖3‑5份和去离子水20‑40份。按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种外周血单个核细胞，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养；细胞接种培养2‑3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO₂培养箱中扩增培养，扩增10‑14天后收集NK细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。

背景技术

NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的效应功能。

在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL-18，typeI IFN,TNF-α等；直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1-ULBP3/NKG2D,AICL/NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物治疗中。

目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。目前体外大规模扩增NK细胞的两种常用方法：

1、滋养细胞(K562细胞)刺激法

以基因工程手段构建滋养细胞，如CD8α-CD137-K562、4-1BBL-K562等，利用这种方法得到NK细胞纯度较高、倍数也较大，但是由于(1)涉及基因转染，成本和步骤较为复杂；(2)需要用到K562细胞(一种肿瘤细胞)，使用者对其安全有一定的顾虑；(3)在NK细胞或者CAR-NK细胞进行药品注册的时候，需要对其进行安全性评价，滋养细胞为一个完整的细胞，涉及到的评价内容会非常复杂，极大的增加了安评的难度和支出。

2、因子刺激方法

传统的NK细胞体外扩增方法，利用一些细胞因子或者因子组合在体外刺激PBMC或者纯化的NK细胞，利用该方法得到的NK细胞一般纯度不高(NK细胞纯度不高意味着，其它杂细胞的含量高，比如T细胞，而T细胞为特异性细胞，如果回输进入人体，容易产生GVHD反应)，倍数也不大(倍数不高意味着终产品中NK细胞的数量少，而数量少就不能达到治疗或者杀伤靶细胞的目的)，也有极端一些的可以得到极高纯度的效应细胞，但是扩增倍数极低，即便延长培养时间也无法达到临床所需的数量。

本发明提供了一种利用因子方法在体外大量扩增NK细胞的方法，该方法可以在12天内达到以下技术效果(1)效应细胞纯度89.88％以上，平均91％；(2)扩增5000倍以上(平均6500倍，最高可达8000倍以上)；(3)杀伤活性不降低；(4)细胞存活率87.21％以上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。