[发明专利]美兰和荧光素钠双染色法于活细胞成像中的应用

说明书

本发明提供了一种用于活细胞成像的荧光染色方法，通过荧光素钠与美兰对细胞进行双重染色，用荧光显微镜检测显现清晰的荧光细胞图像，所获取的图像可以在观察到细胞形态的同时能观察到细胞核形态。

技术领域

本发明涉及细胞染色方法，具体涉及一种利用荧光生物标记物进行双重染色的方法，属于生物技术领域。

背景技术

荧光染色方法与荧光显微技术的结合，使荧光显像在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用，其中细胞成像技术是生命科学技术领域中重要的研究手段。相比于其他技术，荧光染色具有灵敏度高、选择性高、操作简单、反应灵敏等优点，是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。

荧光是一种“光致发光”的冷发光现象。当某种常温物质经特定波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即发出比入射光的波长长的出射光，具有这种性质的出射光即被称为荧光。

荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种。激发光谱指荧光物质在不同波长光的激发下，该物质的某一发光谱线与谱带的强度或发光效率与激发光波长的关系；发射光谱指荧光物质在某一激发光的激发下，其不同波长的发光强度的强弱变化。每种荧光物质都有激发光谱和发射光谱，以及它最适宜的激发波段和发射波段。目前对于荧光的研究主要是研究荧光物质的激发光谱和发射光谱，以找到它们最适宜的激发波段和发射波段，例如临床上广泛使用的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)。

基于5-ALA的荧光检测恶性病变目前临床应用于脑外科、泌尿外科、胃肠外科，其中5-ALA诱导的原卟啉IX(PP IX)荧光检测最近成为一种很有前途的术中检测恶性病变的方法。为了提高5-ALA荧光在强自发荧光条件下的检测精度，已有几种光谱分析方法(Valdes,P.A.et al.(2011)Neurosurg.115,11–17；Xu,H.Rice,B.W.(2009)Journal ofbiomedical optics 14,064011；Harada,K.et al.(2013)International Journal ofMolecular Sciences 14,23140–23152；Koizumi,N.et al.(2013)Ann.Surg.Oncol.20,3541–3548；Kondo,Y.et al.(2014)Int.J.Oncol.45,41–46)。虽然一些研究报道了5-ALA荧光检测方法在临床应用中的有效性，但由于发色团自身荧光背景强，经常出现检测错误。

一些荧光生物标记物已被研究，除了上述5-ALA，目前使用比较广泛的还有荧光素钠(Fluorescein,FS)和吲哚菁绿(ICG)。

荧光素钠(Fluorescein)是一种活体荧光染料，其水溶液可以对细胞胞体轮廓进行标记，用于改善肿瘤组织的可视化，其对肿瘤细胞没有特异性。这种染料在被波长在460–500nm范围内的光激发时，会发出波长在540–690nm的荧光辐射，在医学上有着广泛的应用，特别是在脑肿瘤手术中应用更为广泛(Copeman SM,Coke F,Gouldesbrough C.,Br Med J.(1929)2:233–42；Hamamcioglu MK.et al.,Clin Neurol Neurosurg(2016)143:39-45；O’goshi K,Serup J.,Ski Res Technol.(2006)12:155–61；Koc K.et al.,Br J Neurosurg(2008)22:99-103；Hara T.et al.,Am J Ophthalmol.(1998)126:560–4；Kuroiwa T.etal.,Surg Neurol(1998)50:41-8)。