[发明专利]一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法，包括步骤：将外周血单个核细胞加入含纯因子的自体血清的淋巴细胞无血清培养基中培养16天左右；培养期间，每隔2～3天需要多次添加含纯因子的培养基；培养结束后，经离心处理和氯化钠溶液清洗，达到外周血CIK细胞；向外周血CIK细胞中加入人血清白蛋白后并用氯化钠溶液定容，获得高纯度外周血CIK细胞。该培养方法，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；CIK细胞纯度高、生长快；CIK细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果且扩增倍率高。

技术领域

本发明涉及细胞学领域，尤其涉及一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法。

背景技术

CIK细胞(Cytokine Induced Killer Cell)，是一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是介导细胞毒活性最强的免疫细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞非主要组织相兼容复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞其具有增殖速度快、杀瘤活性高等优点，具有TIL、LAK细胞无法比拟的优势。

现阶段而言，CIK细胞培养是将分离的外周血血单个核细胞(PBMC)用IFN-γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞中有效细胞含量纯度低、细胞杀伤活性弱、且细胞扩增倍率相对不高。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种高纯度、高扩增倍数的外周血CIK细胞的培养方法。

本发明的技术方案如下：

一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：

S1、从外周血中分离出单个核细胞，将所述单个核细胞加入自体血清的淋巴细胞无血清培养基中且该培养基中添加有细胞因子；静置培养16天；

S2、静置培养期间，每隔2～3天需要添加含所述细胞因子的淋巴细胞无血清培养基；

S3、细胞培养结束后，将培养好的外周血CIK细胞收集到离心管中进行离心处理后，收集外周血CIK细胞并用氯化钠溶液反复洗涤2次或3次；

S4、往步骤S3的洗涤后获得的外周血CIK细胞中加入人血清白蛋白，并用氯化钠溶液定容，得到所述高纯度外周血CIK细胞。

较好地，所述培养方法中，所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-18、CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-1β、他克莫司及达肝素钠。

较好地，所述培养方法的步骤S2中，静置培养期间，第3天和第6天，分别需要添加含所述细胞因子的淋巴细胞无血清培养基。

较好地，所述培养方法的步骤S1和S2中，所述细胞因子中，IL-2的浓度为10～3000IU/ml、IL-15的浓度为5～500ng/ml、IL-18的浓度为5～500ng/ml、CD3单克隆抗体的浓度为5～1000ng/ml、IFN-γ的浓度为10～500μg/ml、IL-1β的浓度为10～200ng/ml、他克莫司的浓度为0.01～5ng/ml及达肝素钠的浓度为5～500IU/ml。

较好地，所述培养方法的步骤S1中，所述自体血清是经过56℃灭活过的自体血清，浓度为1-20％。

较好地，所述培养方法的步骤S2中，静置培养期间，第8天、第10天、第12天及第14天，分别需要添加含所述IL-2、他克莫司及达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基；较好地，所述IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。

较好地，所述培养方法中，所述淋巴细胞无血清培养基包括GT-T551H3培养基、CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基及RPMI-1640培养基中的一种