[发明专利]一种培育不结球白菜小孢子植株的方法

权利要求书

1.一种培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于具体包括如下步骤

(1)取样：在不结球白菜的盛花期，摘取不结球白菜花序，加入少量的无菌水保持花蕾湿润，放入4℃冰箱进行低温预处理24h；

(2)挑蕾：用镊子挑选不结球白菜的花蕾，从步骤(1)预处理后的花序中挑选饱满、无病虫害且长度在2～3mm之间的花蕾，放置于离心管中；

(3)花蕾消毒：向离心管中加入质量浓度为1％的NaClO溶液，震荡，弃去NaClO溶液，加入无菌水清洗，弃去无菌水，用1/2NLN-13培养基润洗；

(4)小孢子分离及纯化：取步骤(3)消毒后的花蕾加入1/2NLN-13培养基，研磨，过滤，离心，弃上清液，下层产物待用；

(5)小孢子稀释及分装：将步骤(4)所得下层产物用NLN-13培养基稀释，使混合液中小孢子浓度为1×10⁵～2×10⁵个/mL，优选的，使混合液中小孢子浓度为1×10⁵；向混合液中加入活性炭溶液，使混合液中活性炭终浓度为1mg/mL；优选的，还包括向混合液中加入褪黑素溶液，使混合液中褪黑素终浓度为0.05～0.1mg/L，得到小孢子混合液，将小孢子混合液分装至培养皿中，密封；

(6)培养：将培养皿放入生化培养箱中，避光，32～33℃热激24～32h，再移入人工气候箱，25℃暗培养10～15天，当培养皿中出现白色小点时，放进摇床，以25℃、60r/min、8h/d光强为800～1200cd光照条件震荡培养7天，待胚状体转绿，转移到改良1/2MS固体培养基中培育45～60d，待再生植株长出健壮根系，开始炼苗并移栽到基质中。

2.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(1)中选取花蕾的时间为天气晴朗的早上10点。

3.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(3)中所述质量浓度为1％的NaClO溶液震荡时间为20min；所述无菌水清洗次数为2次，每次5min；1/2NLN-13培养基润洗时间为1min。

4.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(4)中所述研磨的具体操作为：将消毒后的花蕾转移到研磨管中，加入1/2NLN-13培养基，用试管分散机研磨若干次，每次研磨时长为30s；所述过滤的具体操作为：将研磨好后的液体用40μm细胞过滤筛过滤至离心管中；所述离心的具体操作为：将滤液1200r/min离心4min，弃上清液，重复两次。

5.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(5)中所述分装的具体操作为：将小孢子混合液分装到35mm塑料培养皿中，每个培养皿2mL，用封口膜密封。

6.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(6)中33℃热激24h，然后25℃暗培养10天。

7.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(6)中胚状体在25℃、60r/min、8h/d光强为1000cd光照条件震荡培养7天。

8.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(6)中改良1/2MS培养基的配方为：含琼脂蔗糖的1/2MS培养基39.45g/L、琼脂5g/L、2mg/L 6-BA、0.02mg/L NAA。

9.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(6)中待胚状体转绿，转移到改良1/2MS固体培养基中培育60d。

10.根据权利要求1所述的培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于步骤(6)中所述炼苗的具体操作为：将组培瓶盖子虚掩组培瓶上2天，移除盖子培养3天，期间喷洒少量无菌水防止植株萎蔫；将再生植株取出去除根系上固体培养基，移栽到灭菌的无菌基质中，盖上保护罩培养7天，之后将保护罩移除常规管理。