[发明专利]一种NAMPT基因修饰间充质干细胞外泌体的制备方法

说明书

本发明公开了一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：a、构建NAMPT高表达慢病毒载体；b、将NAMPT高表达慢病毒质粒与vsvg包膜质粒、PCMV‑delta R8.2包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集上清；c、用收集的病毒上清感染间充质干细胞，药筛后得到稳定高表达NAMPT基因间充质干细胞株；d、收集高表达NAMPT细胞株培养基，利用外泌体试剂盒提取，获得高表达NAMPT基因的间充质干细胞外泌体。本发明通过NAMPT的慢病毒载体在人脐带间充质干细胞中高表达进而使MSC来源的外泌体NAMPT高表达，从而使其具有有效的抗衰老作用。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体是一类直径在30-150nm之间的纳米级囊泡，可由许多类型的细胞分泌产生，其内容物包含蛋白质、DNA、miRNA、mRNA等，参与细胞间的物质交换和信息交流。外泌体可用于新型理想的无细胞疗法，可以作为天然载体来运输药物，还可以携带细胞释放的信息和物质来调控远端细胞的生物作用，也可以凭借作为细胞微环境中的重要成员成为疾病的预测、诊断、治疗的标志物。

抗衰老领域是当今生命科学领域和社会领域的研究热点。2018年，美国北卡罗莱纳州立大学科学家研究表明，人真皮成纤维细胞分泌的外泌体可以更好地修复光老化引起的皮肤损伤。2019年6月，华盛顿大学医学院的研究人员发现了一种存在于人和小鼠等动物细胞内的烟酰胺磷酸核糖转移酶(eNAMPT)，当把年轻小鼠的eNAMPT注入老年小鼠时，可有效防止衰老相关的功能下降和疾病，甚至延长寿命。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，通过NAMPT的慢病毒载体在人脐带间充质干细胞中高表达进而使MSC来源的外泌体NAMPT高表达，从而使其具有有效的抗衰老作用，可以有效替代间充质干细胞成为具有抗衰老作用的新型药物。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

a、构建NAMPT高表达慢病毒载体；

b、将NAMPT高表达慢病毒质粒与vsvg包膜质粒、PCMV-delta R8.2包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集上清；

c、用收集的病毒上清感染间充质干细胞，药筛后得到稳定高表达NAMPT 基因间充质干细胞株；

d、收集高表达NAMPT细胞株培养基，利用外泌体试剂盒提取，获得高表达NAMPT基因的间充质干细胞外泌体。

本发明为解决其技术问题所采用的进一步技术方案是：

进一步地说，所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

进一步地说，所述步骤b中所述NAMPT高表达慢病毒质粒中慢病毒的元件顺序为CMV-MCS-3XFLAG-6xHis-IRES-puro。

进一步地说，所述步骤b中质粒共转染的各质粒浓度比为 PLVX-IRES-NAMPT-puro:PCMV-delta R8.2:vsvg＝3:2:1。

进一步地说，所述步骤b中收集上清后500g离心5min，0.45μm滤器过滤。

进一步地说，所述步骤c中感染间充质干细胞时病毒上清与MEM培养基两者的体积之比为1:3。

进一步地说，所述步骤c中感染间充质干细胞加入100mg/ml鲑精蛋白。

进一步地说，所述步骤c中嘌呤霉素药物筛选浓度为0.4μg/ml。

进一步地说，所述间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。