[发明专利]一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法

说明书

本发明公开一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法，属于生物工程技术领域。本发明在不添加UDPG的条件下，利用廉价底物ST在体外先经UGT76G1催化为RA，再经EUGT11催化产生RD，最终被UGT76G1转化为RM，旨在用较简单的生产方法，更廉价的底物，得到高品质的甜味剂RM。当三重启动子启动转录时，限速酶EUGT11酶活是单启动子控制转录时的2.13倍，且在酶活力配比为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39的条件下，该体系将10mM ST转化为3.79±0.31mM莱鲍迪苷M，较之前提升了2.35倍，为低成本高效酶法合成RM提供技术支持。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M(RM)的方法。

背景技术

甜叶菊原产于巴拉圭和巴西，其叶片中可提取出一类甜度高且热量低的糖苷类化合物，几个世纪以来，一直被南美洲的人们用作为天然甜味剂，包括甜菊苷(Stevioside，ST)，莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)，莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，RD)和莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，RM)。其中ST和RA含量较为丰富(约占叶片干重的7％和3％)，但与RD和RM相比，它们的甜度不及后者，且随添加量不断增加，苦涩味逐渐显现，故在应用于食品生产时会影响产品风味^[1]。而RD和RM作为高品质甜味剂，甜度为蔗糖的400倍，口感更加纯净，但是含量十分稀少，仅占叶片干重的0.3％^[2]。利用传统物理方法从叶片中提纯莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的产量远远不能满足市场需求，且生产量少，工艺繁琐，成本较高^[3][4]。

甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1可以在糖基供体UDPG存在的条件下，催化两种糖基转移反应：由ST生成RA^[5]，或由RD产生RM^[6]。而水稻来源的糖基转移酶EUGT11则可以利用糖基供体UDPG，以RA为底物催化生成RD^[7]。在以上三个糖基转移反应中，均需要UDPG作为糖基供体，但UDPG价格昂贵，使甜味剂的生产成本大幅增加。而蔗糖合成酶可利用廉价原料UDP，在蔗糖存在的情况下，将葡萄糖基转移至UDP，生成UDPG和果糖(图1b)，且该过程可逆，可以实现UDP-UDPG的循环反应^{[8][9][10][11]}。当糖基转移反应与SUS1介导的UDP-UDPG循环反应偶联，不直接添加昂贵底物UDPG时，各糖基转移反应也能正常进行。

目前多数生产方法仅利用单个酶与蔗糖合成酶偶联产生单一种类的糖苷，且产物大多为RA或RD^[12][13]，在合成莱鲍迪苷M时也常以昂贵原料莱鲍迪苷D作为底物，使得生产成本较高，且产量不高。

参考文献：

[1]Prakash I,Markosyan A,Bunders C.Development of Next GenerationStevia Sweetener:Rebaudioside M[J].Foods,2014,3(1):162–175.

[2]Chen L,Cai R,Weng Jet al.Production of rebaudioside D fromstevioside using a UGTSL2 Asn358Phe mutant in a multi-enzyme system[J].Microbial Biotechnology,2020,13(4):974–983.

[3]Olsson K,Carlsen S,Semmler Aet al.Microbial production of next-generation stevia sweeteners[J].Microbial Cell Factories,BioMed Central,2016,15(1):1–14.