[发明专利]一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法

权利要求书

1.一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于：包括如下步骤：

分别构建异源表达的UGT76G1，SUS1的重组菌，以及构建高效表达EUGT11的重组菌，所述高效表达EUGT11的重组菌以pET-22b（+）质粒为出发载体，以大肠杆菌作为宿主菌，在多重启动子操控下高效表达EUGT11，分别经诱导发酵产酶后以细胞粗酶液进行催化反应，利用蔗糖、ST和UDP，将SUS1介导的UDP-UDPG循环反应与三步糖基转移反应偶联形成级联反应，将三个单级联反应串联，在体外形成通路，建立一锅法多酶级联反应体系，催化ST高效合成莱鲍迪苷M；

所述一锅法多酶级联反应体系中蛋白质量比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11=1：（2～4）：（12.3～36.9）；

所述UGT76G1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述SUS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述EUGT11的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的多重启动子为三重启动子；

所述的启动子为T7启动子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述UGT76G1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述SUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50 mU/mL，换算成蛋白质量用量为0.8mg/mL。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

一锅法多酶级联反应体系中酶活力比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11=1：（1～2）：（2.13～6.39）；

一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50 mU/mL。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

一锅法多酶级联反应体系中酶活力比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11=1：（1～2）：（1.81～5.43）；

一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50 mU/mL。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述的一锅法多酶级联反应体系中，蔗糖的起始反应浓度为100～700 mM； ST的起始反应浓度为1～10mM；UDP的起始反应浓度为2～20mM；

所述的催化反应的条件为35～40℃，180～220r/min催化反应24～48h。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

诱导发酵中诱导剂为IPTG，IPTG在发酵体系中的浓度为0.5～1 mM；

所述的细胞粗酶液为发酵得到的菌体经超声破碎所获得的含酶的粗酶液；

所述的一锅法多酶级联反应体系为：蔗糖和UDP经SUS1催化生成UDPG；UDPG和ST经UGT76G1催化生成RA；UDPG和RA经EUGT11催化生成RD；UDPG和RD经UGT76G1催化生成莱鲍迪苷M。