[发明专利]质粒载体及其在靶向猪COL1A1位点定点整合外源基因中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及质粒载体及其在靶向猪COL1A1基因下游序列(以下简称为：COL1A1位点)定点整合外源基因中的应用。本发明提供的质粒载体包括：COL1A1位点同源左臂，外源基因和COL1A1位点同源右臂，该载体是依托CRISPR/Cas9打靶系统所设计，它能够将外源基因精确的引入到猪的COL1A1位点中，以解决传统转基因技术效率低下，外源基因随机整合，不同个体表达量差异大，整合位置检测难度大的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及质粒载体及其在靶向猪COL1A1位点定点整合外源基因中的应用。

背景技术

转基因猪在农业与医学研究中发挥着重要的作用。一方面猪作为一种重要的畜牧用物种，另一方面，猪与人相对于人与小鼠等其他动物更为接近，医学研究上也发挥着不小的作用，比如猪与人的器官大小接近，这一点使异种移植成为了可能，再者猪与人的各器官的结构与血液生理生化指标相似，转基因猪成为更好的动物模型。

转基因猪在很多领域已经得到应用，然而却依然受到一定的限制，转基因的效率与整合位点的不确定性是主要原因。CRISPR/Cas系统，广泛存在于真细菌和古生菌中,是一个用来保护宿主不受病毒二次侵害的获得性免疫系统。该系统由CRISPR体系转录出的RNA和Cas体系翻译出的蛋白相结合来发挥切割DNA的作用。目前在基因组编辑领域应用最为广泛的CRISPR/Cas系统是II型的SpCas9系统，它使用crRNAs与tracrRNAs嵌合形成的引导RNA与核酸酶Cas9组成复合体来识别、切割DNA，在基因组的特定位点造成DNA双链断裂。相较于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas9系统以其极度简单、低构建成本等优势，迅速成为了基因组编辑的主流技术，并普及发展成为了现代生命科学实验室必不可少的研究工具之一。

基因组安全港湾是基因组中能够容纳新遗传物质整合的位点，以确保外源基因可预测地发挥作用。2014年赖良学课题组针对猪开发了Rosa26位点，在其中引入了loxp位点，并成功将RFP基因置换进入并成功表达，使外源基因能在该位点高效表达。但是Rosa26是一个全身性表达的友好性基因，具有自己的Rosa26启动子，在该位点插入的基因往往会导致基因在全身性的广泛表达，然而转基因技术在实际运用中有时需要组织特异性表达，该位点很难实现。Col1a1位点是2006年由Caroline Beard首先使用，作为制备转基因鼠四环素诱导调控外源基因表达的整合位点，开发成为一个新的安全港湾。Col1A1位点位于猪第12号染色体的COL1A1基因3'UTR下游，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。在猪的基因组中定位COL1A1这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供质粒载体及其在靶向猪COL1A1位点定点整合外源基因中的应用。

本发明提供的质粒载体，其包括：Col1A1位点同源左臂，外源基因插入位点和Col1A1位点；

所述同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的质粒载体包括顺序连接的：Col1A1位点同源左臂，猪ICAM2启动子，外源基因、polyA1和Col1A1位点同源右臂。

一些实施例中，所述质粒载体包括顺序连接的：Col1A1位点同源左臂，猪ICAM2启动子，外源基因、polyA1、Col1A1位点同源右臂、PGK promoter、HSV-TK和poly A2。

一些具体实施例中，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一些具体实施例中，所述质粒载体担载的外源基因为TM基因，其插入方式通过Overlap PCR技术实现无缝连接。