[发明专利]质粒载体及其在靶向猪COL1A1位点定点整合外源基因中的应用在审
| 申请号： | 202110371942.0 | 申请日： | 2021-04-07 |
| 公开（公告）号： | CN112852877A | 公开（公告）日： | 2021-05-28 |
| 发明（设计）人： | 潘登科;杜嘉祥;王永 | 申请（专利权）人： | 成都中科奥格生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 温可睿 |
| 地址： | 610041 四川省成都市中国(四川)自由贸*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 质粒 载体 及其 靶向 col1a1 定点 整合 基因 中的 应用 | ||
1.质粒载体，其包括：COL1A1位点同源左臂，外源基因和COL1A1位点同源右臂；
所述同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，包括顺序连接的：COL1A1位点同源左臂，猪ICAM2启动子，外源基因、polyA-1和COL1A1位点同源右臂。
3.根据权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，包括顺序连接的：COL1A1位点同源左臂，猪ICAM2启动子，外源基因、polyA-1、COL1A1位点同源右臂、PGK启动子、HSV-TK和polyA-2。
4.根据权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求4所述的质粒载体，其特征在于，所述外源基因为TM基因，其构建方式利用Overlap PCR，与猪ICAM2启动子和polyA-1无缝连接。
6.一种质粒载体组合，其特征在于，包括定点整合载体和敲除载体：
所述定点整合载体为权利要求1～5任一项所述的质粒载体；
所述敲除载体为含有sgRNA的pX458载体；所述sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
7.权利要求5所述的质粒载体组合，在靶向猪COL1A1位点定点整合外源基因中的应用。
8.靶向猪COL1A1位点定点整合外源基因的方法，其包括：
将权利要求6所述的敲除载体，和线性化的权利要求5所述定点整合载体，转染猪体细胞，筛选获得阳性克隆。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述猪体细胞为猪耳成纤维细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，转染猪耳成纤维细胞后，与卵母细胞融合，获得获得整合外源基因的猪。
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