[发明专利]一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽及其应用

权利要求书

1. 一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽，其特征在于，所述降血糖多肽的氨基酸序列为Tyr-Phe-Phe-Met，其由下述方法制备得到：

（1）牡丹籽粕脱脂

将油用牡丹籽粕粉碎后，以1g:4～6mL的料液比加入正己烷，常温搅拌浸提30～40min，沉淀15～20min后抽滤，收集残渣，连续浸提两次后，将残渣置于通风橱内自然挥发正己烷，得脱脂牡丹籽粕粉；

（2）碱溶酸沉法提取牡丹蛋白

取脱脂牡丹籽粕粉，以1g:8～12mL的料液比加入蒸馏水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH至9～10，在室温下搅拌3～5h，然后离心，取上清液用1mol/L HCl水溶液将pH调节至4～5，在4℃下静置2～3h后，离心，收集沉淀，用1mol/L NaOH水溶液将其调节为中性后冻干，得到牡丹蛋白粉；

（3）双酶连续酶解

将冻干的牡丹蛋白粉和蒸馏水以1g:20～30mL的料液比混合，将混合物在80～90℃下预热15～30min，用1mol/L NaOH水溶液将pH调节至8.5～10，加入蛋白粉质量3%～5%的碱性蛋白酶在50～60℃下水解2～3h，在水解过程中通过加入0.5mol/L NaOH水溶液将反应液pH始终维持在8.5～10；酶解结束后，将体系置于80～95℃水浴中以终止酶解反应；将该体系再次冷却至40～50℃后维持此温度，将pH调节至8～9，加入蛋白粉质量3%～5%的胰蛋白酶水解2～3h，在水解过程中加入0.5mol/L NaOH溶液维持pH值为8～9；酶解结束后将体系置于80～95℃水浴终止酶解反应，冷却至室温后，加入1mol/L HCl水溶液调节溶液至中性，离心，取上清液得到牡丹籽粕酶解液；

（4）超滤分离多肽

将牡丹籽粕酶解液置于超滤杯中，先经10kDa的超滤膜截留，取出＜10kDa的部分再次使用1kDa的超滤膜截留，超滤过程中保持工作压力为0.1～0.2MPa，保留分子量＜1kDa部分；

（5）反相高效液相色谱分离多肽

采用反相高效液相色谱对超滤后分子量＜1kDa的部分进行分离，分离条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径20～50 nm、粒径5～10 µm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是三氟乙酸体积浓度为0.1%的超纯水溶液，流动相B是三氟乙酸体积浓度为0.1%的乙腈溶液，进行梯度洗脱，流动相梯度选择：0～5分钟内5%流动相B洗脱，5～35分钟内5%～60%流动相B洗脱，35～60分钟内60%～100%流动相B洗脱，检测波长为214 nm，流速为1 mL/min；收集40%～80%流动相B洗脱之间的最高峰肽组分，冻干得到降血糖多肽。

2.权利要求1所述的降血糖多肽在制备降血糖药物中的应用。