[发明专利]一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)乳腺组织采集：乳腺组织来自三元杂交母猪，将乳腺组织用无菌PBS缓冲液冲洗3次后，放入PBS缓冲液中，并置于冰盒，备用；

(2)乳腺组织前处理：将乳腺组织剪成1mm³的小碎块，用5mL无菌PBS缓冲液重悬，以1000g/min的速度离心10min，收集乳腺组织块，备用；

(3)乳腺组织块的消化：将乳腺组织块转移至无菌离心管中，按1:2的体积比加入乳腺组织块与质量分数为0.25％的胶原酶Ⅰ消化液，将离心管置于37℃恒温摇床，以100r/min的速度震荡消化3h；随后以1000g/min的速度离心10min，去掉上清液，收集沉淀；向沉淀中加入2倍体积的质量分数为0.25％的胰蛋白酶，置于37℃恒温摇床，以100r/min的速度震荡消化15min；最后加入10mL完全培养基终止消化，以1000g/min的速度离心5min，收集沉淀，备用；

(4)乳腺组织块的接种：使用移液枪将沉淀中的组织块均匀接种至培养皿中，组织块之间的间距为0.5cm，并吸掉组织块周围多余的培养基，每个组织块滴加50μL胎牛血清，待组织块贴壁后，加入完全培养基培养，此时乳腺上皮细胞开始生长，每48h更换一次培养基；

(5)细胞纯化：根据成纤维细胞与乳腺上皮细胞对胰蛋白酶有不同的敏感性，利用差速消化法进行纯化；具体步骤为：向细胞培养皿中加入1mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，于37℃消化30s，加入5mL完全培养基终止消化，更换新的培养基进行培养；细胞纯化1～2次即可得到高纯度的乳腺上皮细胞；

(6)细胞消化传代：当培养皿中乳腺上皮细胞生长至培养皿底面积的90％时，对细胞进行传代培养；传代培养时，首先弃掉原培养基中的培养液，加入PBS缓冲液轻微冲洗，静置20s，弃PBS缓冲液，重复三次；将质量分数为0.25％的胰蛋白酶按直径10cm的培养皿加1mL的用量加入，于37℃消化2～3min后镜检，当细胞脱离培养皿后，加入5mL完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞使细胞团被打散，随后将细胞悬液转移至离心管，以1000g/min的速度离心5min后弃上清，用完全培养基再清洗一次；最终得到的乳腺上皮细胞均分3-4份，转移至新的培养皿中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每48h更换一次培养基；

(7)细胞冻存：细胞冻存时，每个冻存管包含1mL冻存液，其中细胞的数量为1×10⁶个，分装好的冻存管放入含异丙醇的冻存盒中，于-80℃冻存16h，此后将细胞转移至液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所述的高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体方法为：三元杂交母猪采用8月龄的健康杜长大三元杂交母猪，将杜长大三元杂交母猪屠宰后，使用碘酊溶液对母猪乳头进行清洗，随后用体积分数为75％的酒精进行消毒处理；以第二对或第三对乳头为圆心，使用手术刀环切乳腺，环切半径2cm，环切深度皮下3cm；将所切割的乳腺组织用无菌PBS缓冲液冲洗3次后，放入PBS缓冲液中，并置于冰盒，备用；所述PBS缓冲液含体积分数为3％的双抗，所述双抗为含青霉素100IU/mL和链霉素100μg/mL的水溶液。

3.根据权利要求2所述的高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，其特征在于，采集乳腺组织时选择乳头发育良好的乳腺。

4.根据权利要求3所述的高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体方法为：将整个乳腺组织放入体积分数为75％的酒精中浸泡30min后，切取1cm³的乳腺组织用无菌PBS缓冲液冲洗至表面清洁，再用眼科剪将乳腺组织剪成1mm³小碎块，加入5mL无菌PBS缓冲液重悬浮组织，以1000g/min的速度离心10min，去掉上清液和悬浮的脂肪组织，保留下层乳腺组织块，重复上述步骤，直到上清液透明且无悬浮组织，收集乳腺组织块，备用。