[发明专利]疏水性超大孔微球协同超滤技术的蛋白质复性方法

说明书

本发明提供了一种降低膜污染、提高变性蛋白质操作浓度的蛋白质超滤复性方法，属于生物技术领域，主要是应用具有超大孔结构的疏水性微球的搅拌作用，降低浓差极化的程度，减缓膜污染；同时利用疏水性超大孔微球协助复性和超滤复性的同步进行，提高变性蛋白质的操作浓度，进而提高整个超滤复性过程的蛋白质复性效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是应用疏水性超大孔微球的协同效应，降低超滤复性过程中的膜污染，提高变性蛋白质的初始操作浓度，进而提高超滤复性的效率。

背景技术

基因工程技术的快速发展使得蛋白质的异源表达成为现代生物医药产业最常用的方法，但基因工程所得的蛋白质往往以包涵体(无活性的非水溶性聚集体)的形式存在。而包涵体又须经过蛋白质复性这一重要过程才能获得其天然结构和生物学活性，但该过程的产率较低。因此，包涵体复性是许多重组蛋白质药物生产过程的关键步骤，也是制药生物技术产业化的瓶颈问题。

目前，常用的蛋白质复性技术有稀释法、透析法、色谱法、超滤法、分子伴侣辅助复性法和折叠助剂协助复性法等。其中，超滤复性是通过选择合适的超滤膜，使变性剂能够透过，而变性蛋白质则被截留，由此实现变性剂的缓慢去除和变性蛋白质天然构象的逐渐恢复。尽管超滤复性技术具有操作简单、可线性放大等优点，但有关超滤技术在蛋白质复性领域的研究报道相对较少，其主要原因在于：在超滤复性过程中，由于变性蛋白质容易聚集产生沉淀，进而引发严重的膜污染；同时，也使得超滤复性只能在较低的变性蛋白质浓度下进行，限制了整个过程的蛋白质复性效率。因此，降低超滤复性过程中的膜污染，同时尽量提高变性蛋白质的操作浓度，是扩大超滤复性技术工业化应用的关键问题。本发明利用疏水性超大孔微球的搅拌作用，降低超滤复性过程中浓差极化的程度，减缓膜污染的进程。同时利用疏水性超大孔微球(折叠助剂)协助复性和超滤复性的结合，提高变性蛋白质的初始操作浓度，进而提高整个超滤复性过程的蛋白质复性效率。

发明内容

本发明提供了一种能够降低膜污染，且提高变性蛋白质操作浓度的超滤复性方法。

本发明提供的疏水性超大孔微球的制备方法为：

1)多孔聚苯乙烯(PS)微球的制备：将稳定剂(聚乙烯醇，2g)、抑制剂(对苯二酚，0.01g)和水相调节剂(硫酸钠，0.02g)溶解于超纯水中配成水相溶液；将引发剂(过氧化苯甲酰，0.16g)、单体(苯乙烯，3g)、交联剂(二乙烯基苯，1g)、稀释剂(十六烷，0.08g)和表面活性剂(Span80，2g)混合均匀，直至完全溶解，即为油相溶液。将配制好的水相溶液转移至三口烧瓶中，在机械搅拌下，将油相均匀分散于水相中制成O/W乳液，在氮气氛围下进行悬浮聚合反应24h(75℃)，然后进行洗涤并干燥，即可获得多孔聚苯乙烯(PS)微球。

2)Ps-Br的合成：称取10g干燥的PS微球置于250mL的三口烧瓶中，并用100mL二硫化碳溶胀过夜，再加入15.58g氯化铝并搅拌均匀，最后利用滴液漏斗向反应体系中缓慢滴加含有2-溴异丁酰溴(21g)的二硫化碳溶液(50mL)，待加料完毕后升温至50℃反应5h，反应结束后依次用乙醇、3％冰盐酸和去离子水清洗微球。最后在50℃下将微球进行真空干燥至恒重。

3)疏水性超大孔微球PS-P(NIPAM-co-BMA)的制备：称取2.5g PS-Br微球置于梨形瓶内，抽真空并充入氮气，重复三次，备用。称取一定配比的CuCl/CuCl₂、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、甲基丙烯酸丁酯(BMA)、溶剂(甲醇/水)和配体Me6TREN加入Schlenk瓶中，待体系完全溶解后，液氮冷冻-抽真空-解冻循环三次；用双针将Schlenk瓶中的体系转移至梨形瓶内，水浴振荡，40℃下反应23h；反应完成后，依次用丙酮、甲醇、0.2M的EDTA溶液进行洗涤，并使用丙酮进行抽提处理4h，抽提结束后用超纯水洗涤过滤，并置于50℃干燥4h，得到疏水性超大孔微球PS-P(NIPAM-co-BMA)。

本发明采取的技术路线是：

1)向超滤复性装置中加入变性蛋白质溶液；