[发明专利]一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法

说明书

本发明公开一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，该方法首先将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内，然后将芯片通过升降温装置进行PCR扩增反应，随后对扩增后的芯片进行拍照，以图像处理的方法获取液滴的位置参数，并基于该位置参数计算每个液滴的荧光均值，对比流式检测方案，可保证液滴的平稳性，且可降低液滴遭受污染的风险，同时，还提高了检测速度。

技术领域

本发明涉及微滴式数字PCR技术领域，尤其涉及一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法。

背景技术

PCR又称聚合酶链式反应，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、快速、简便、易自动化等许多优点，能将目的基因或某一DNA片段，数小时内扩增至百万乃至千万倍，在临床诊断、法医学调查、生物技术等领域有着广泛而重要的应用。

随着检测要求的不断提高，传统PCR系统难以精确的测定基因拷贝数，无法对基因突变定性和定量，而数字PCR即Digital PCR的问世很好地解决了这个问题。数字PCR通过将一个样本分为几千到几十万份，分配到不同的反应单元，每个单元最多包含一个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。数字PCR不依赖扩增曲线的循环阈值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA分子的个数，是一种核酸分子绝对定量技术。

数字PCR仪现如今又分为微孔式和微滴式，其核心原理都是将含有核酸模板的标准PCR反应体系平均分配成几千至几十万个PCR反应单元，使每个反应单元中尽可能含有最多一个模板分子，再进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有无进行计数，最后通过统计学泊松分布进行绝对定量，而在对液滴荧光进行检测计算时，其采用流式检测技术，其需要将液滴一个个推到激光点上照射从而激发出荧光值，检测存在难以控制、液滴稳定性差、且检测时间较长等不足之处。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，该方法首先将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内，然后将芯片通过升降温装置进行PCR扩增反应，随后对扩增后的芯片进行拍照，以图像处理的方法获取液滴的位置参数，并基于该位置参数计算每个液滴的荧光均值，对比流式检测方案，可保证液滴的平稳性，且可降低液滴遭受污染的风险，同时，还提高了检测速度。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，包括以下步骤：

S1：获取已生成液滴并完成PCR反应的芯片；

S2：获取芯片的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片；

S3：对获取的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片进行预处理；

S4：基于预处理后的明场或暗场照片，获取每个液滴的位置参数并在照片内标识每个液滴；

S5：基于S4获取的每个液滴的位置参数，将每个液滴的位置映射于各个荧光通道照片内的对应液滴上；

S6：基于每个液滴的位置参数，计算每个荧光通道照片内的相应液滴的荧光均值；

S7：基于每个液滴的荧光均值，筛选出阴性和阳性液滴。

进一步地，所述S1具体包括以下步骤：

S11：将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内；

S12：将芯片通过升降温装置进行PCR反应。

进一步地，所述S2具体包括以下步骤：

S21：通过LED灯照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的明场或暗场照片；