[发明专利]一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用

说明书

本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用，所述引物探针组合物包括针对MPL基因W515L、W515S和W515A突变的PCR上游引物、PCR下游引物和探针；所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点互补；所述PCR下游引物的3’端末2位碱基为错配碱基。本发明根据MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点设计特异性引物探针，不需要多重PCR、实现了采用一对引物探针在一个反应体系中同时检测MPL基因W515L、W515S和W515A三种突变的效果，在MPL基因突变检测领域具有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用。

背景技术

促血小板生成素受体(MPL)属于造血因子受体家族，与配体结合能够激活JAK-STAT等信号转导途径，对调节髓细胞的增生和巨核细胞的成熟具有重要作用。目前，已发现多种MPL基因突变类型，3％～5％的原发性血小板增多症(ET)和5％～10％的原发性骨髓纤维化(PMF)存在MPL基因突变。

MPL W515存在多种突变类型，目前已知的主要有MPL W515L、MPL W515S、MPLW515A、MPL W515K、MPL W515R等。传统的MPL检测方法为Sanger测序法，存在操作繁琐、检测时间长、灵敏度低的问题；二代测序虽然有较高的灵敏度，但是同样存在操作繁琐、检测时间长、成本高的问题。

现有的荧光定量PCR检测方法，在一个反应体系中通常只能检测一种突变类型，当检测多种突变类型时，需要配制多个反应体系才能完成检测。多重PCR可以实现在一个反应体系中检测多种突变的效果，例如，CN112410407A公开了同时检测两种或三种MPN致病基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒，所述引物组包括两对引物，其中第一对引物为JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R，第二对引物为MPL-F和MPL-R。但是多重PCR涉及多对引物，需要反复优化反应体系，且对PCR反应酶的要求较高，多对引物间的相互干扰可能降低检测的灵敏度或特异性。

因此，需要一种能够快速简便、灵敏特异检测MPL基因常见突变类型的试剂盒。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针及其应用，所述引物探针基于荧光定量PCR，在一个反应体系中同时检测MPL W515L/S/A三种突变类型，简便快速，灵敏度高，特异性好，成本低廉。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括针对MPL基因W515L、W515S和W515A突变的PCR上游引物、PCR下游引物和探针；

所述PCR下游引物的3’端末1位碱基与MPL基因W515L、W515S和W515A突变位点互补；

所述PCR下游引物的3’端末2位碱基为错配碱基。

本发明中，采用3’末1位碱基与突变位点互补、3’端末2位碱基为错配碱基的引物进行PCR扩增，实现了仅扩增突变型MPL基因、不扩增野生型MPL基因的效果，利用荧光标记的特异性探针对PCR产物进行检测，实现了在一个反应体系中利用一对引物探针检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的效果。

优选地，根据MPL基因W515L、W515S和W515A突变碱基，将PCR下游引物的3’末1位碱基设计为突变碱基的互补简并碱基R(A/G)，实现了利用一对引物探针同时检测MPL基因W515L、W515S和W515A突变的效果。

优选地，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。