[发明专利]一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法

说明书

本发明提供了一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，属于功能多肽筛选技术领域。为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，该杂合肽融合了猪源抗菌肽cecropin P1的活性区域和牛源抗菌肽的活性区域的优势获得新型的杂合肽，通过人工合成杂合肽基因并将目的基因连接在质粒pYES2‑ɑ上获得新型杂合肽重组酵母菌株，使用半乳糖诱导其表达，上清液进一步纯化后即可用于食品保鲜，尤其对于新鲜猪肉保鲜和牛奶保鲜具有很好的效果。

技术领域

本发明属于功能多肽筛选技术领域，涉及一种一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，消费需求和方式的转变，生鲜食品已成为城乡居民生活中的必需品。但由于保鲜技术的相对滞后，生鲜食品产后容易腐败变质，成为制约我国农产品加工业和食品工业发展的重要因素之一。生鲜食品保鲜已成为当今农业、食品企业、物流业和消费者所关心的热点问题。多重耐药性超级细菌的频繁出现，让人们意识到滥用抗生素造成的药物残留以及环境污染等问题的严重性。近年来，生物保鲜技术由于其环保且不会产生耐药性越来越受到青睐。

生物保鲜技术是将某些具有抑菌或杀菌活性的天然物质配制成适当浓度的溶液，通过浸泡喷淋或涂膜等方式应用于生鲜食品中，进而达到防腐保鲜的效果。生物保鲜技术的机理包括抑制或杀灭食品中的微生物，隔离食品与空气的接触，延缓氧化作用，调节贮藏环境的气体组成及相对湿度等因生物保鲜剂具有天然、安全、简便等优点，故应用范围不断扩大，已成为食品保鲜技术的研究热点之一。

目前生物保鲜方面研究较多的是利用微生物菌体及其代谢产物保鲜、生物天然提取物保鲜和基因工程技术保鲜。抗菌肽是具有抗微生物活性的小分子多肽，其产生于抗致病菌的防御反应过程中。由于抗菌肽来源广，相对分子质量小，且具有强阳离子性、良好的热稳定性、酸碱稳定性和蛋白酶稳定性以及较为广泛的抑菌谱，因此使用绿色、稳定、安全、小分子的抗菌肽代替抗生素用于生物保鲜以及抑菌防腐已成近年来研究的热点。

抗菌肽cecropin P1是1989年Lee等首先从猪小肠分离得到的，后来研究表明，其实际上来源于猪肠道内的蛔虫。由31个氨基酸组成，分子量为3.3KDa。二级结构为：ɑ-螺旋，N端为强碱性，C端为强疏水性，且中间可形成柔性弯曲的谷氨酸－甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列，其螺旋－卷曲－螺旋结构对抗菌活性具有特殊的重要性。牛源抗菌肽BMAP-27和BMAP-28分别由27和28个氨基酸，在C末端分别包含一个抗菌活性的ɑ-螺旋结构域，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌活性。但目前抗菌肽cecropin P1还存在抑菌活性不强以及溶血性较高的特点，如何最大程度上发挥或增强抗菌肽的抑菌活性并降低其细胞毒性成为抗菌肽的研究的焦点所在。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，该杂合肽融合了猪源抗菌肽cecropin P1的活性区域和牛源抗菌肽的活性区域的优势获得新型的杂合肽，通过人工合成杂合肽基因并将目的基因连接在质粒pYES2-ɑ上获得新型杂合肽重组酵母菌株，使用半乳糖诱导其表达，上清液进一步纯化后即可用于食品保鲜，尤其对于新鲜猪肉保鲜和牛奶保鲜具有很好的效果。

本发明的目的之一是提供一种用于食品保鲜的杂合肽，该杂合肽包含33个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ.No1所示。该杂合肽的抗菌效果好，且细胞毒性低，提高其抗菌效果，降低其细胞毒性。

用于编码上述杂合肽的核苷酸序列如SEQ：No.2所示；其上游引物如SEQ：No.3所示；其下游引物如SEQ：No.4所示；

本发明还提供一种上述杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，其具体包括如下步骤：

1)人工合成杂合肽的基因序列，将杂合肽基因进行PCR扩增后使用连接酶将其连入重组酵母表达载体pYES2-ɑ中，构建表达重组质粒pYES2-ɑ-SS-33；