[发明专利]一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法

说明书

本发明属于生物技术与分子生物学技术领域，具体涉及一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法。本发明提供的鉴定方法主要包括如下过程：从样本中提取全基因组DNA；以DNA样本为模板，扩增含有ITS2序列的片段，并对其进行HRM‑PCR分析；通过ITS2‑HRM曲线的差异区分药材布渣叶和海南破布叶。本发明提供的方法操作简单，实现了药材布渣叶与混淆品海南破布叶的准确、高效、快速鉴定。

技术领域

本发明属于生物技术与分子生物学技术领域，具体涉及一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法。

背景技术

布渣叶药材为椴树科植物破布叶(Microcos paniculata L.)的干燥叶，又名蓑衣子、破布叶、麻布叶等。主产于广东、广西、海南、云南等省。2020年版《中国药典》记载布渣叶性微酸，凉。归脾、胃经。具有消食化滞，清热利湿之功效。用于饮食积滞，感冒发热，湿热黄疸。现代研究表明布渣叶富含异鼠李黄素、山柰黄素、槲皮黄素等多种黄酮类活性成分。具有解热、镇痛、退黄、降血脂、抗炎和保护心血管等作用。同时布渣叶为药食同源药材，常用于清热类中成药和广东凉茶等。海南破布叶(Microcos chungii(Merr.)Chun)为椴树科破布叶属植物，广泛应用于家具、器具等用材，未作为药用植物。

布渣叶药材在我国尤其是岭南地区为常用中草药。海南破布叶与布渣叶的基原植物同为椴树科破布叶属植物，形态相似，不易识别。因此，有些地区常出现海南破布叶被当作布渣叶药材混用的现象。然而，海南破布叶未被列为药用植物，药材药性、功效均未知，两者混淆使用给临床用药造成了潜在威胁。因海南破布叶充当布渣叶药材，均使用相同的组织部位(叶)，依赖传统的形态、显微方法不易准确地鉴定。

现有技术中，有研究人员采用DNA条形码技术建立了布渣叶的特征核苷酸序列，为布渣叶的鉴定提供了依据(汤欢等人，凉茶药材布渣叶及其混伪品的DNA条形码鉴定.中国药学杂志,2015年17期)。但是，并未见到应用该方法针对药材布渣叶与其混伪品的其他分子鉴定研究，而迄今为止亦未发现任何药材布渣叶与海南破布叶的HRM结合DNA条形码鉴定方法的报道。

因此，亟待寻找一种准确、高效、快捷、可视化的方法来鉴定药材布渣叶与海南破布叶。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种药材布渣叶与海南破布叶的分子鉴定方法。本发明提供的方法操作过程简单，实现了药材布渣叶与混淆品海南破布叶的准确、高效、快速鉴定。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鉴定药材布渣叶或其基原植物或植物海南破布叶的方法，其包括如下步骤：

S1、根据提供的药材样本或植物样本，提取样本中的DNA，获得样本中的全基因组DNA；

S2、以步骤S1获得的样本中的全基因组DNA为模板，经HRM-PCR扩增，获得包含完整的ITS2基因间隔区的扩增产物；

S3、对步骤S2所得包含完整的ITS2基因间隔区的扩增产物进行HRM曲线比对分析，即可。

优选地，所述药材布渣叶的基原植物为破布叶。

优选地，步骤S2所述的HRM-PCR扩增时反应体系共配制25μL，包含2×HRM-PCRMaster Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加灭菌双蒸水至25μL；扩增程序为94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；HRM 2s 75-95℃。

优选地，步骤S2所述HRM-PCR扩增时，采用的引物为ITS2，其上游引物序列如SEQID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL。

5’-YGACTCTCGGCAACGGATA-3’(SEQ ID NO.1)；