[发明专利]双荧光团的酶测定法

说明书

本发明公开了提供用于酶活性的快速、灵敏和准确的基于细胞的测定的组合物和方法，特别是用于与肉毒杆菌毒素相关联的酶活性。本发明提供了一种表达构建体的细胞，其中所述构建体包括锚定域、切割位点，和具有两个或多个相同的报告肽的报告域。酶活性在切割位点将报告域释放进入其中发生多个降解事件的胞质溶胶。在信号中所观察到的变化与酶活性成正比。

本申请是申请号为“201480067579.1”、发明名称为“双荧光团的酶测定法”、申请日为“2014年10月24日”的专利申请的分案申请。

本申请要求享有美国临时申请61/895533(2013年10月25日提交)，美国临时申请61/897352(2013年10月30日提交)，美国临时申请62/014586(2014年6月19日提交)，以及美国临时申请为62/058532(2014年10月1日提交)的优先权。

技术领域

本发明的领域为蛋白酶测定法，特别是那些涉及肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素的蛋白酶测定法。

技术背景

肉毒杆菌神经毒素(BoNTs)由肉毒杆菌产生，其是已知的最强的毒素之一。这些毒素是公认的食物中毒的来源，往往导致受害者的严重损伤甚至死亡。有许多结构类似的肉毒杆菌神经毒素或血清型(BoNT/A-G和被提出的BoNT/H)，每一个由一个重链(大约100KD)和一个轻链(大约50kD)组成。重链通过受体介导的内吞作用介导毒素进入靶细胞。一旦进入内部，轻链从内体小泡腔转移入胞质溶胶，并且充当依赖锌的蛋白酶(zinc-dependentprotease)来切割介导囊泡—靶膜融合的底物特异性蛋白，所述囊泡—靶膜融合的这一过程是神经递质释放的中心。

BoNT底物蛋白包括细胞膜蛋白突触融合蛋白(syntaxin)，外周膜蛋白SNAP-25和囊泡膜蛋白小突触泡蛋白(synaptobrevin，Syb)。这些蛋白被统称为SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺—敏感因子附着蛋白受体)蛋白。SNARE蛋白的切割阻止了囊泡与细胞膜的融合，且消除了神经递质在神经肌肉接头的释放。在SNARE蛋白中，突触融合蛋白和SNAP-25通常存在于靶膜上，从而被称为t—SNARE，而小突触泡蛋白只与突触内的突触小泡相关联，从而被称为v-SNARE。这三种蛋白一起形成的复合体被认为是介导囊泡膜和质膜之间融合所需的最小机构。BoNT/A,BoNT/E,和BoNT/C切割SNAP-25，而BoNT/B,BoNT/D,BoNT/F和BoNT/G在单个且不同的位点上切割小突触泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25，BoNT/C也切割突触融合蛋白。由于BoNT充当酶起作用，甚至微小的量都会对受影响的个体造成破坏性的影响。

虽然肉毒杆菌神经毒素是食物中毒的来源，并具有用作生物恐怖主义武器的潜在威胁，但肉毒杆菌神经毒素也有治疗性的应用。最近，肉毒杆菌神经毒素已用于治疗与不希望的肌肉收缩(如斜视)有关的病症，并用于持续的偏头痛的治疗。它也被广泛地用于化妆品用途，其中皮下小肌肉的选择性麻痹能暂时减少与年龄相关的皱纹的出现。伴随着如此广泛的用途，存在对灵敏且快速地鉴定BoNT蛋白的需要。这个过程由于需要准确定量BoNT活性，而不是简单地定量BoNT蛋白质存在的量而变得复杂，如用于分离这些蛋白的纯化过程能够导致显著程度的变性以及导致这些蛋白质的失活。

目前，一个常用的用来检测BoNTs和定量它们的活性的方法是使用小鼠进行毒力测定。这种方法需要使用大量的小鼠，耗时，且不能用于进行毒素催化动力学的研究。也已经开发了许多基于针对BoNT蛋白的抗体的免疫测定系统，但即使这样的测定可用于定量存在的BoNT蛋白的量，它们也不能用来确定毒素的酶活性。为了检测这些毒素的酶活性，已开发多种方法，以检测BoNT的反应产物，例如，使用HPLC或使用针对切割产物的免疫测定法。然而这些方法中一般复杂耗时，并且可能是昂贵的(例如，利用专门的抗体)，这使得它们难以实现自动化并且不适用于大规模筛选。