[发明专利]一种同时检测单增李斯特菌CC87和88型菌株的引物、试剂盒以及方法

说明书

本发明提供了一种同时检测单增李斯特菌CC87和CC88型菌株的引物组和用于检测单增李斯特菌CC87和CC88型菌株的特异性靶标序列，以及包括所述引物组的检测试剂盒。可同时检测CC87和CC88型菌株的多个特异性靶标，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，而且具有高通量特点，具有灵敏度高、经济快速、操作简单和准确性高等优点。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测单核细胞增生李斯特菌CC87和88菌株的引物、试剂盒以及方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)是一种重要的兼性厌氧革兰氏食源性致病菌，可引起败血症、脑膜炎、脑膜脑炎、胸肌炎和等严重李斯特菌病，孕妇甚至导致流产等严重后果，敏感人群主要为老年人、新生儿、孕妇和免疫力低下者，致死率为20％-30％。近年来，我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民身体健康造成一定的威胁。

单核细胞增生李斯特菌遗传多样性丰富，具有14种血清型，分别为1/2a， 1/2b，1/2c，3a，3b，3c，4a，4b，4c，4ab，4d，4e，4h和7。脉冲场凝胶电泳 (pulse field gelelectrophoresis，PFGE)是单增李斯特菌分子分型的“金标准”，但随着DNA测序技术的发展，目前多位点序列分型(multilocus sequence typing， MLST)是单增李斯特菌遗传多样性分析的流行方法，其分辨力、稳定性均可与 PFGE媲美，比血清分型具有更高的分辨力和可靠性。据法国巴斯德研究所 BIGSdb-Lm数据库统计，目前单增李斯特菌已发现2331序列型(sequence types， STs)(截至2020年12月15日)。单增李斯特菌具有耐受低温、低水活度、宽范围pH和高盐等能力，因此广泛存在于食品加工、水体和土壤等环境中。目前，我国许多学者报道在食品样品和临床源样本中，克隆复合群(clonal complex， CC)87型菌株均为优势型别，可能与其能够耐受一定剂量的消毒剂、携带李斯特菌毒力岛-4(LIPI-4)等特征相关；同时有研究表明CC87型菌株是长期持续性污染食品生产加工的主要基因型，对食品安全带来严重的潜在威胁。

目前，采用MLST技术可以准确鉴定单增李斯特菌的CC型别，但目前DNA 序列测定成本较高、耗时相对较长、且测序的准确性也直接影响MLST分型结果的准确性。随着微生物全基因组测序技术的发展，基于比较基因组学分析获得CC型特异性DNA检测靶标，可以开发快速高通量、廉价、灵敏度高的PCR 鉴定技术。

多重PCR是在同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性 DNA序列靶标的PCR技术。目前已广泛应用于微生物血清分型、分子分型、病原体检测、转基因鉴定、遗传疾病诊断等生物、医学领域。多重PCR具有以下优势：(1)高通量，在一次操作中可对多达384个样品进行鉴定；(2)廉价高效，同一PCR扩增体系可同时检测多个特异性靶标，且无需进行DNA序列测定，根据靶标序列DNA条带扩增结果即可判断；(3)易于操作、耗时短，在同一PCR反应中实现多个靶标一步法同时扩增，150min内即可获得准确结果；(4) 准确性高，实现多个靶标的同步特异性扩增，大大降低了假阳性的可能性。随着引物对数量的增加，引物间的抑制作用降低了多重PCR的检测通量，在多重 PCR技术的实际应用过程中，由于在同一反应管内添加多对引物，引物的非特异性扩增、引物间二聚体形成、PCR反应体系优化以达到每个靶标DNA序列都能有效扩增等问题限制了多重PCR技术的应用。因此，开发高通量、高灵敏度和准确可靠的单增李斯特菌CC87和CC88型菌株多重PCR检测技术及其相应的试剂盒，对食品生产企业、检验检疫部门检测/监测单增李斯特菌污染具有重要的价值。

发明内容

本发明基于比较基因组学分析技术开发的多重PCR技术对单增李斯特菌 CC87和CC88型菌株的多个特异性检测靶标同时进行检测，可直接鉴定单增李斯特菌CC87和CC88型菌株。