[发明专利]一种同时检测多种鞘磷脂代谢物的方法

说明书

本发明公开了一种同时检测多种鞘磷脂代谢物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)取血清样品，加入检测鞘氨醇、二氢鞘氨醇及S1P、dhS1P对应的同位素内标以及沉淀剂，进行蛋白沉淀后，离心取上清；(2)在步骤(1)获得的上清中加入稀释液稀释后进行LC‑MS/MS分析，测定四种鞘磷脂代谢物的含量。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及多种鞘磷脂代谢物的检测方法。

背景技术

鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)是一种由神经酰胺的C-1羟基上连接了磷酸胆碱(或磷酸乙醇胺)构成的鞘脂。它不仅是细胞膜的主要结构成分，同时还是参与调控细胞生长分化、增殖、凋亡等多种细胞功能的关键信号分子，包括调节生长因子受体和细胞外基质蛋白的活动，它也是一些微生物、毒素和病毒的结合位点。随着人们对存在于动物和酵母中SM的深入研究发现,SM及其代谢产物鞘氨醇(sphingosine,Sph)、二氢鞘氨醇(dihydrosphingosine,dhSph)及它们的1-磷酸化物S1P、dhS1P被认为是具有显著生物活性的关键分子，化学结构式见图1，它们参与多种疾病病理进程的调控，如免疫系统疾病，癌症，血管生成，血管渗漏以及心肌梗塞等。

然而，将血液中鞘磷脂及其代谢物水平作为疾病的生物标志物的研究仍处于起步阶段。由于Sph和S1P，dhSph与dhS1P存在相互转化，体内浓度低，化学结构相似，同时测量这些标志物存在一定的技术困难。虽然目前有很多方法可以用于鞘磷脂的分析，如放射性同位素标记方法，高效液相色谱法，质谱法等。放射性标记实验特异性差，不能区分结构类似的磷脂分子，且前处理步骤复杂，提取效率较低，不适合用于高通量筛选实验。荧光HPLC方法常检测经衍生化的S1P或荧光标记的鞘氨醇，有时为消除样品其他成分干扰，需要进行繁琐费力的提取及柱前衍生化步骤，检测流程耗时。液相色谱串联质谱(Liquidchromatography-triple quadrupole mass spectrometry，LC-MS/MS)方法是目前检测小分子标志物尤其是脂类物质的可靠方法，它具有灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强等优点，适用于大批样本的快速分析。LC-MS/MS可通过多反应监测(Multiple reactionmonitoring,MRM)模式选择一组特征的母离子和碎片离子进行定量，这种检测模式排除了一些分子量相近、结构相似的干扰物质，可以大大降低质谱基线信号，提高信噪比，实现检测的高灵敏度和高特异性，是一种有效的定量监测鞘脂类物质的方法。

近年来，有学者运用LC-MS/MS技术进行鞘磷脂类物质的检测，但样本处理方法较为繁琐，也很少有同时测定Sph，S1P，dhSph与dhS1P四种鞘磷脂代谢物相关的研究报道。例如2013年JT Brozinick等人在《Plasma sphingolipids are biomarkers ofmetabolicsyndrome in non-human primates maintained on aWestern-style diet》文章中使用甲醇-二氯甲烷提取液对样本进行前处理，检测Sph，S1P与dhS1P，提取伴随着提取、吹干、重组等多个步骤，操作复杂，且对实验人员的毒性相对较大。而2019年Wee Siong Chew等人在《Large-scale lipidomics identifies associations between plasma sphingolipidsand T2DM incidence》则使用了1-丁醇-甲醇萃取溶剂从血浆样品中提取脂质，对于S1P的分析，还额外经过了重氮甲烷衍生化步骤，进样时对于S1P和其它鞘磷脂代谢物选择不同的色谱柱进行分析，整个样品前处理过程耗时较长，不适合用于大批量样本的快速测定。虽然2011年Tian Lan等研究者在《Simultaneous determination of sphingosine andsphingosine 1-phosphate in biological samples by liquid chromatography–tandemmass spectrometry》文章中也使用甲醇法一步提取法测定鞘磷脂代谢物，但是4分钟的进样方法只能分析Sph和S1P两种分析物，通量较低，无法测定同样在疾病生理过程中具有重要生理意义的dhSph和dhS1P。