[发明专利]非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组、试剂盒及方法

说明书

本公开提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本公开还提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测试剂盒及方法。本公开的试剂盒及其检测方法具有覆盖范围广，检测时间短，检测效率高，可用于猪的唾液、鼻腔拭子、血液、组织等样本中的非洲猪瘟病毒检测。

技术领域

本公开涉及生物技术的领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒P72基因 荧光探针PCR检测引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、烈性、出血性、 高度接触性传染病，强毒株可在感染后约5-14天内致死家猪，致死率接 近100％。由于非洲猪瘟病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和 抗体，没有有效的疫苗用于防疫，且无特效治疗药物，所以建立一种快 速、准确的检测方法对及时有效防控非洲猪瘟显得尤为重要。研发可检 测尽可能多的毒株的检测方法必不可少。

目前，市面上已经有用于非洲猪瘟病毒核酸检测的操作简单、快速 方便的实时荧光定量PCR试剂盒，已经被广泛应用于非洲猪瘟病毒基因 检测。但是，这些试剂盒的或是检测灵敏度不足；或是基于个别毒株设 计的引物探针，只能检测为数不多的病毒毒株。有鉴于此，本发明人研 究和设计出了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物、试剂盒及方法。

发明内容

本公开提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探 针组、试剂盒及方法，在扩大检测覆盖毒株数的同时，以提高检测灵敏 度。

根据本公开的一个方面，一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR 检测引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核 苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧 光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

根据本公开的至少一个实施方式，所述特异性荧光探针的荧光报告 基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460 中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的 一种。

根据本公开的一个方面，一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR 检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组。

根据本公开的至少一个实施方式，所述试剂盒还包括2×Taq PCR Mix。

根据本公开的至少一个实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照及阳 性对照。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阴性对照为双蒸水。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阳性对照为含P72基因的克 隆质粒，所述克隆质粒为pUC19；所述P72基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

根据本公开的一个方面，一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR 检测方法，提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用上所述 的试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测 样本，确定待测样本是否存在非洲猪病病毒P72基因。

根据本公开的至少一个实施方式，所述实时荧光PCR反应体系为： PCR扩增的反应总体积为25μl，其中包括12.5μl的2×Taq PCR Mix， 1.25μl的10μM正向引物和1.25μl的10μM反向引物，0.5ul的10μM 特异性荧光探针，5μl的模板核酸样本，4.5μl的超纯水。