[发明专利]检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒。本发明检测中华蜜蜂囊状幼虫病的探针，其核苷酸序列为序列表中序列1。检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组的试剂盒，包括所述的探针和核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对。本发明可以快速有效地对中华蜜蜂囊状幼虫病进行诊断，通过快速诊断可以有效控制疾病的传播和蔓延，可以取得较大的经济效益；也将为今后研究病毒感染量与发病情况之间的关系提供方法；为预测囊状幼虫病的发生与发展提供依据；亦对蜂业生产过程中保障蜂产品安全做出贡献。

技术领域

本发明涉及了中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法。适用于中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断、实验室检疫鉴定和流行病学调查。

背景技术

蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病毒引起的一种蜜蜂幼虫传染病。病死的蜜蜂幼虫呈囊状，囊中充满粒状水液。成年蜂受感染无明显症状，常能自愈。

美国学者White最早分别于1913和1917年提出囊状幼虫病是由滤过性病毒引起的。英国Bailey等于1964年观察到囊状幼虫病病毒粒子形态，该粒子具有传染性，定名为囊状幼虫病毒(Sacbrood bee virus，简称SBV)。在分类学上，该病原属于小核糖核酸病毒目(Picornavirales)，传染性软化病毒科(Iflaviridae)，传染性软化病毒属(Iflavirus)。病毒粒子无囊膜，为直径28-30纳米的正二十面体病毒粒子，沉降系数为160S，浮密度(CsCl)为1.35g/mL(pH7.0-9.0，4.0时不稳定)。病毒粒子的三维结构已解析，最外面是衣壳，由三种结构蛋白VP1、VP2和VP3组成，中间是由VP4组成的无定形膜状物，与衣壳松散连接，最里面是病毒核酸。病毒基因组为正义单链RNA，长度约为8800bp。基因组编码一个大的多聚蛋白，其中3种结构蛋白位于其近5’端，非结构蛋白(解旋酶、蛋白酶和复制酶)位于其近3’端。多聚蛋白经体内加工会被切割成上述有功能的蛋白。基因组的两侧各存在一个非翻译区(UTRs)，5’末端与VPg蛋白共价连接，3’末端连有一个Poly(A)尾。

中华蜜蜂囊状幼虫病是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒引起的一种中华蜜蜂幼虫传染病。

1971年冬，广东省佛冈、从化、增城等地首先发生了中蜂囊状幼虫病毒病，次年全省流行，很快迅速蔓延到福建、江苏、江西、浙江、安徽、湖南、四川、青海、贵州等省，至2019年，已蔓延至全国的中蜂饲养区。病害在新区暴发时，传染速度极快，危害性很大，可造成30％-90％的蜂群损失。老病区病害虽已趋向平稳，但某些年份也会突然重新短暂的流行。近几年又有新的变异毒株出现，对中蜂饲养威胁很大。在印度、泰国和尼泊尔等国的东方蜜蜂中也发现了此病的蔓延。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒病的病原是中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbroodvirus，CSBV)。CSBV病毒结构主要参考SBV的相关研究。

每当气候变化大，温湿度不稳定，蜂群又处于繁殖期时容易发病。发病严重与否主要与气温有关。温度低，温差大，蜂群保温差，易发病，特别是早春寒流袭击后，病害发展更为迅速。春季摇蜜蜂群易受冻再加上机械损伤，常表现为每摇一次蜜，病害加重一次。

病害流行与食物也有关。病害的大暴发一般伴随着大流蜜期的到来而出现。在福建，季节上多见于清明后和冬初。温度不稳，而蜂群子脾大，一旦缺蜜，幼虫营养不足，质量下降，抵抗力也下降。流蜜盛期，气温晴暖，有时却病害大流行，主要原因是取蜜太频繁，群内蜜粉不足，幼虫缺食。

夏、秋季节，温度稳定，天气干燥，疾病自然好转。蜂王减少产卵，成年蜂与幼虫相比占比大。为了度夏，群内一般饲料较足，幼虫饲喂好，发育健壮，少量病虫很快被清除，残存于巢内的病毒在干燥的夏季迅速失去感染力。

与蜜蜂囊状幼虫病一样，病虫是主要传染源，通过工蜂的饲喂活动传播至健虫。早春和初冬，被侵染的工蜂则是传染源。传染经口进行，病毒随食物进入幼虫体内。