[发明专利]一种人iPSC来源的锥体神经细胞前体细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种人iPSC来源的锥体神经细胞前体细胞及其制备方法和应用，属于脊髓损伤治疗技术领域，通过Dorsomorphin小分子化合物诱导人iPSC分化为锥体神经细胞前体细胞，分化比例高达90％以上，本发明提供的锥体神经细胞前体细胞，移植大鼠撞击模型后，能够显著改善大鼠的运动功能。将所述锥体神经细胞前体细胞移植到免疫缺陷小鼠以及经免疫抑制剂注射后的大鼠，所述分化锥体神经细胞前体细胞能够移植存活，并表现出较强的轴突投射能力。

技术领域

本发明属于脊髓损伤治疗技术领域，尤其涉及一种人iPSC来源的锥体神经细胞前体细胞及其制备方法和应用。

背景技术

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是一种严重的神经系统损伤疾病，是由于外部创伤造成了脊髓灰质和白质受损坏死，损伤区继发炎症反应，形成的血栓加重脊髓缺血，而胶质细胞大量增生形成的瘢痕组织阻碍神经纤维的再生，导致神经元和神经纤维的变形坏死。脊髓损伤能导致患者不同程度的截瘫。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。由于脊髓损伤所导致的社会经济损失，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。

到目前为止脊髓损伤仍是难以治愈的疾病之一，神经的修复再生较难，因此，如何有效保护神经细胞促进神经修复是恢复神经功能的决定性因素，目前较多用于此研究的细胞为干细胞，如胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)、间充质干细胞(Marrowstromal cells，MSCs)、神经干细胞/神经前体细(Neural stem/progenitor cells，NSPCs)、嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)、施旺细胞(Schwann cells，SCs)和诱导多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)等。

目前在研究的细胞对于脊髓损伤的治疗主要作用在神经的营养支持及保护方面，主要体现在移植细胞可以分泌神经营养因子或支持作用以促进宿主神经细胞的再生，然而损伤轴突跨损伤部位的长距离稳健再生以及随后的临床改善仍然是一个具体的挑战。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人iPSC来源的锥体神经细胞前体细胞及其制备方法和应用；将所述锥体神经细胞前体细胞(PNPs)移植大鼠后，PNPs发育成锥体神经元，其轴突向宿主脊髓组织中延伸，延伸方向主要向尾侧；移植细胞接受脊髓上神经元的突触连接，且与宿主神经元在病灶尾部形成下游突触连接，能够重建神经元的连接回路，从而恢复脊髓损伤大鼠的运动功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种人iPSC来源的锥体神经细胞前体细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将人iPSC接种于matrigel基质胶上，并用iPSC细胞专用培养基中预培养2d；

2)将上述细胞培养液直接更换为第一诱导分化培养基，进行第一诱导分化培养获得第一分化细胞；

3)将所述第一分化细胞置于第二诱导分化培养基中进行第二诱导分化培养获得第二分化细胞；

4)将所述第二分化细胞分离下来，接种于铺有PDL/Laminin的培养皿中，并置于第三诱导分化培养基中进行第三诱导分化培养获得锥体神经细胞前体细胞；

所述第一诱导分化培养基为DDM培养基+终浓度0.2～2μmol/L的Dorsomorphin+20mL/L的B27；

所述第一诱导分化培养的时间为14～18d；

所述第二诱导分化培养基为DDM培养基+20mL/L的B27；

所述第二诱导分化培养的时间为7～9d；