[发明专利]利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用

说明书

本发明公开了利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用。所述微生物自发光生物传感器包括含有自发光操纵子luxABCDE operon的报告元件和含有启动子114的感应元件。所述的微生物自发光生物传感器能够感应不同浓度的爆炸物分子，而产生不同RLU值的自发光，并将爆炸物分子浓度与自发光RLU值进行偶联，进而实现了对爆炸物分子的实时荧光检测，还能克服需要荧光素酶才能够产生荧光进行检测的缺点，与其他检测方法相比，利用所述微生物自发光生物传感器检测爆炸物分子操作更简便、信号收集更容易，能够检测到浓度范围较广的爆炸物分子，因此具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用。

背景技术

利用合成生物学思路，通过挖掘自然界中对特定化合物敏感的生物识别元件，将其与报告元件连接组成基因线路，转化至遗传背景清晰，操作简单的模式微生物(例如大肠杆菌)中，构建获得微生物传感器。这种微生物传感器可以用于环境污染检测、食品检测等领域。其中生物识别元件包括负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控蛋白等等，可特异性地感应靶标化合物，引起下游报告元件产生信号。一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP)，分别产生绿色荧光、黄色荧光和红色荧光等可以被检测的感应信号。荧光检测的特点是技术成熟、信号强，但是荧光蛋白的荧光信号需要借助于特定波长紫外光的激发，而且荧光信号的收集需要借助于荧光检测仪器。荧光素酶(Luc)也常被用作报告元件，例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶等等，但以荧光素酶作为报告元件时，需在系统中加入荧光素作为底物，在荧光素酶催化作用下，才能够产生荧光。

战区残留爆炸物(例如地雷)对于生命安全、生态系统都造成了不可修复的损伤，因此针对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。通过生物检测技术是对残留地雷进行检测是一种有效的手段。爆炸物(例如地雷)的有效成份为TNT，TNT可分解为多种化合物，如1，3-二硝基苯(1，3-DNB)和2，4-二硝基甲苯(2，4-DNT)。以色列科学家ShimshonBelkin于2014年报道了对爆炸物分子2，4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2，4-DNT的生物感应系统，其对2，4-DNT的检测限为19.4mg/L。此生物传感器以GFP作为报告元件，在野外进行爆炸物探测时，需使用特制的仪器进行紫外波长激发，同时进行绿色荧光的收集，这对于实际的应用是不友好的。另外，野外情况较为复杂，多种非GFP物质能够在紫外光激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。

因此，需要研发一种无需荧光素酶作用，又可以不受其他非GFP物质影响的新的爆炸物感应器或感应系统。

发明内容

本发明提供了利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用，所述微生物自发光生物传感器中含有自发光操纵子和启动子，可以实现对爆炸物的实时荧光检测。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将自发光操纵子luxABCDE operon利用PCR扩增、纯化回收，其与质粒pACYCDuet-1同时使用EcoR I和Hind III进行双酶切，将luxABCDE operon片段与质粒酶切片段以2∶5的质量比进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含氯霉素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-lumPleio或p-lumVf；