[发明专利]幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法

说明书

本发明公开了幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法。本发明提供的菌落培养方法包括初次分离、冷冻保存复活、单个菌落生长及传代。该方法具有初次分离和传代培养相同的良好效能。本发明还提供幽门螺杆菌培养效能评价方法。本发明为幽门螺杆菌的快速、高效地分离培养传代提供有力工具，同时为幽门螺杆菌培养方法提供效能评价指标。

技术领域

本发明涉及微生物培养技术，具体地说，涉及幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成及其效能评价方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是微需氧、能在人类胃肠粘膜持续定植并引起各种胃炎、十二指肠球炎和消化性溃疡最常见的致病菌，也和胃癌、胃MALT淋巴瘤密切相关，幽门螺杆菌感染率可达50％以上；并且和胃肠外感染疾病也有相关，如肺炎、菌血症、血清糖化血红蛋白水平相关等。因此诊断幽门螺杆菌感染很有必要。诊断幽门螺杆菌感染有多种技术，分为过筛试验和确诊试验。过筛试验包括脲酶试验、病理组织形态学检查、UBT试验、血清抗体、粪便抗原和分子生物学技术等；确诊试验只有幽门螺杆菌分离培养和免疫组化技术，幽门螺杆菌分离培养是所有诊断技术最特异的方法。常规病理形态学诊断并不能排除和幽门螺杆菌相似的弯曲菌和其它螺杆菌定植或感染。由于胃内有脲酶阳性的其它细菌存在，UBT和脲酶试验会产生假阳性结果，血清抗体可能反映继往感染，粪便抗原敏感性较差，分子生物学技术要求高，并且这些技术都不能提供可靠的药敏试验结果。幽门螺杆菌分离培养是这些诊断方法的“金标准”，并且是表型药敏试验和基因分型的必须过程。为了预防和治疗幽门螺杆菌感染引起的疾病，进行幽门螺杆菌快速分离培养有重要意义。培养分为初次分离(primary isolation)和传代培养(subculture)。菌落形成包括从人体标本初次分离菌落形成和传代培养的菌落形成。初次分离是将包含幽门螺杆菌活细胞的组织标本接种在合适的分离培养基(primary culture)并使其细胞生长尽可能多的菌落。传代培养是将幽门螺杆菌培养物接种在传代培养基并使其良好生长。分离培养基和传代培养基应该不同，组织标本通常含有除幽门螺杆菌之外的杂菌，需要在分离培养基添加抑制杂菌生长的抗生素而不影响幽门螺杆菌生长。传代培养基不需要添加抗生素，其他成分也可以与分离培养基不同，主要用于幽门螺杆菌生物学特征分析、表型药敏试验等试验。传代培养包括在平板培养基上菌落和冷冻保存培养物复活的菌落生长。传代培养复活率受培养基成分、稳定性等因素影响。影响幽门螺杆菌初次分离结果有二个重要因素：分离复活率(Recovery rates)和分离时间。分离复活率决定于分离敏感性，受很多因素影响，包括患者是否使用抗生素等治疗、取材部位和数量、取材和处理标本方式及过程、运送培养基、分离培养基和分离培养条件等，致使初次分离培养敏感性变化较大(60–90％)。分离培养基抑制胃肠粘膜杂菌生长的效能，也会影响幽门螺杆菌分离复活率。尽管培养幽门螺杆菌有很多培养基，但快速、敏感的分离方法还未见报道。应用Columbia琼脂马血培养基从胃粘膜组织标本分离幽门螺杆菌2-10天，应用GC琼脂培养基分离幽门螺杆菌4-10天。快速分离培养的本质就是将含有幽门螺杆菌可培养的活细胞标本在合适的培养基上快速生长形成幽门螺杆菌菌落。幽门螺杆菌分离培养的影响因素和分离培养基密切相关。另一个重要问题是，幽门螺杆菌初次分离成功后，但传代培养失败，致使药敏试验等无法完成。有文献报道传代培养存活率(药敏完成率)只有84.8％，这说明幽门螺杆菌传代培养方法也存在重大缺陷。关于应用初次分离培养基作为传代培养基进行培养，从而敏感、快速形成幽门螺杆菌菌落还没有文献报道，对于幽门螺杆菌敏感、快速分离培养菌落形成方法也没有效能评价方法，培养基效能应满足公式：初次分离培养基＝传代培养基。

发明内容

本发明目的在于提供一种幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成方法，该方法具有初次分离和传代培养相同的良好效能。

本发明的另一目的是提供幽门螺杆菌培养效能评价方法，提供其效能评价指标。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供的幽门螺杆菌敏感、快速培养菌落形成方法，包括以下步骤：

I、初次分离