[发明专利]一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用

说明书

一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR‑T细胞的制备方法，包括如下步骤：S1，构建PD1基因sgRNA质粒pGL3‑U6‑hPD1‑sgRNA和LMP1‑CAR细胞质粒LMP1‑CAR PiggyBac Transposon，将pGL3‑U6‑hPD1‑sgRNA和LMP1‑CAR PiggyBac Transposon质粒与电转缓冲液混合，制得电转混合液，并用电转混合液转染PBMC细胞，得到转染后的PBMC细胞；S2，将转染后的PBMC细胞转入T细胞培养基，用磁珠激活CD3阳性T细胞，并培养扩增转染后的PBMC细胞，获得敲除PD1的LMP1‑CAR‑T细胞。本发明采用靶向LMP1的CAR‑T细胞联合敲除PD1的联合治疗，对患者的T细胞进行PD1敲除，纠正免疫逃逸，恢复患者的免疫功能，增强CAR‑T细胞攻击淋巴瘤的效应。在制备EVB淋巴瘤诊断试剂或治疗药物中的应用具有重要的临床意义。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，尤其涉及一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用。

背景技术

EBV病毒是重要的致瘤病毒，引发一系列淋巴细胞恶性克隆，难医治且容易复发。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)治疗是目前治疗难治复发血液系统肿瘤的重要方法，针对B细胞急性白血病，淋巴瘤，获得了非常好的疗效数据。但是存在一些问题，比如因缺乏肿瘤特异性的靶抗原导致的脱靶效应以及严重的CRS(细胞因子释放综合征)，因此靶点的选择是CAR-T细胞治疗重要的研究内容。

淋巴瘤末期患者的肿瘤免疫逃逸，主要表现为患者T细胞PD1分子的上调和淋巴瘤PDL1的上调，导致约30％的患者无法获得足够的数量和功能的自体T细胞，无法进行CAR-T细胞治疗。绝大多数的EBV淋巴瘤存在的PD1和PDL1的上调都是因为LMP1的调控导致的，因此敲除T细胞PD1纠正肿瘤免疫逃逸，是淋巴瘤末期患者进行CAR-T细胞治疗的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了可特异性敲除PD1，且不会产生严重的CRS的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用。

一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，构建PD1基因sgRNA质粒pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR细胞质粒LMP1-CARPiggyBac Transposon，将pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR PiggyBac Transposon质粒与电转缓冲液混合，制得电转混合液，并用电转混合液转染PBMC细胞，得到转染后的PBMC细胞；

S2，将转染后的PBMC细胞转入T细胞培养基，用磁珠激活CD3阳性T细胞，并培养扩增转染后的PBMC细胞，获得敲除PD1的LMP1-CAR-T细胞。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒的PD1基因序列选自5'-GGN(19)GG、5'-GN(20)GG和5'-N(21)GG中的一种。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒的构建方法为：

S1，在PD1基因的sgRNA核苷酸链序列的5’加上CCGG，合成正向寡核苷酸，对应互补链序列的5’加上CACG，合成反向寡核苷酸；

S2，将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸成对变性、退火后，形成可连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

S3，将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒。