[发明专利]一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用

权利要求书

1.一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，构建PD1基因sgRNA质粒pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR细胞质粒LMP1-CARPiggyBac Transposon，将pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR PiggyBac Transposon质粒与电转缓冲液混合，制得电转混合液，并用电转混合液转染PBMC细胞，得到转染后的PBMC细胞；

S2，将转染后的PBMC细胞转入T细胞培养基，用磁珠激活CD3阳性T细胞，并培养扩增转染后的PBMC细胞，获得敲除PD1的LMP1-CAR-T细胞。

2.如权利要求1所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒的PD1基因序列选自5'-GGN(19)GG、5'-GN(20)GG和5'-N(21)GG中的一种。

3.如权利要求2所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒的构建方法为：

S1，在PD1基因的sgRNA核苷酸链序列的5'加上CCGG，合成正向寡核苷酸，对应互补链序列的5'加上CACG，合成反向寡核苷酸；

S2，将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸成对变性、退火后，形成可连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

S3，将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒。

4.如权利要求1所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述LMP1-CARPiggyBac Transposon质粒的构建方法为：

S1，依次连接抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区，并合成基因序列片段；

S2，将基因序列片段插入到Piggybac转座子载体中，并用柱离心法提取质粒，得到能表达LMP1靶点CAR-T的质粒LMP1-CARPiggyBac Transposon。

5.如权利要求4所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤S1所述抗LMP1单链抗体的轻链前还包括信号肽，抗LMP1单链抗体的轻链和抗LMP1单链抗体的重链之间还包括轻重链间隔区。

6.如权利要求1所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述磁珠为偶联有CD3/CD28抗体的磁珠。

7.如权利要求1所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述PBMC细胞制备方法如下：

S1，采集外周血，用PBS稀释抗凝血后加入装有淋巴细胞分离液的离心管中慢升慢降离心；

S2，吸取离心后的白膜层转入离心管，加入PBS，慢升慢降离心，弃上清，保留沉淀，重复加入PBS和离心步骤2次，即得PBMC细胞。

8.如权利要求1所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，将pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒、pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒、LMP1-CAR PiggyBacTransposon质粒和Super PiggyBac Transposase质粒与T细胞核转染试剂盒中的电转缓冲液混合，获得包含该四种质粒的电转混合液，用该电转混合液悬起1-2×107个PBMC细胞进行电转。

9.如权利要求1所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2所述T细胞培养基为含10％FBS的RPMI-1640培养基。

10.如权利要求1-9任一所述的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞在制备EVB淋巴瘤诊断试剂或治疗药物中的应用。