[发明专利]用于鉴别FAdV-4和DAdV-4的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒

说明书

本发明提供一种用于鉴别禽4型腺病毒(FAdV‑4)和鸭4型腺病毒(DAdV‑4)的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，本发明利用所述引物建立的检测方法具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见仅需一组引物就可对感染禽类的腺病毒科禽腺病毒属的两种4型腺病毒(FAdV‑4和DAdV‑4)进行鉴别的实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明涉及一种用于鉴别禽4型腺病毒(FAdV-4)和鸭4型腺病毒(DAdV-4)的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)是2019年在我国南方地区发现一种鸭新型腺病毒病。对该病毒基因组进行分析发现，其主要基因编码蛋白均和鸭群中前期发现的鸭1型腺病毒、鸭2型腺病毒和鸭3型腺病毒相关基因的核苷酸和氨基酸同源性均低于80％。遗传进化分析表明，DAdV-4属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，但处于一个独立的遗传进化分支，将其命名为鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中也证实存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染(命名为DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)，测定的DBP基因和鸭4型腺病毒参考株GD-2019株(GenBank登录号MN733730)核苷酸同源性为100％。

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus 4，FAdV)分为五亚群(A-E)，具有12种血清型。FAdV-Ⅰ的五亚群包括A型(FAdV-1)、B型(FAdV-5)、C型(FAdV-4和FAdV-10)、D型(FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9和FAdV-11)和E型(FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a和FAdV-8b)。一般而言，FAdV感染主要是亚临床症状(或危害较小)。然而，从2015年夏天起，中国许多省份出现了高致病性血清型病毒(FAdV-4)的爆发。这些爆发通常多发生在肉雏鸡和蛋鸡中，随后在我国鸭群中也存在大量FAdV-4感染的报道，该病与包涵体肝炎(IBH)、心包积液综合征(HPS)等临床症状密切有关。流行病学研究证实，当前鸭群中存在对鸭群健康养殖危害极大的腺病毒科禽腺病毒属的两种4型腺病毒(FAdV-4和DAdV-4)流行，这就给疫病的鉴别诊断带来现实需求。

实时荧光定量PCR方法(Real time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参(或者外参)对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。双重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测两种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。通常，对两个病原进行双重实时荧光定量PCR鉴别诊断的检测时需要分别设计特异性的引物(每个病原2条特异性引物，2个病原需要4条特异性引物)，再分别建立方法的后组合优化条件后建立双重实时荧光定量PCR鉴别诊断方法。本发明基于鸭群中存在对鸭群健康养殖危害极大的腺病毒科禽腺病毒属的两种4型腺病毒(FAdV-4和DAdV-4)基因序列特征，巧妙设计一种仅需2条特异性引物即可对FAdV-4和DAdV-4感染进行鉴别诊断，可简化操作程序、节约成本，又可快速用于开展鸭群中存在对鸭群健康养殖危害极大的腺病毒科禽腺病毒属的两种4型腺病毒(FAdV-4和DAdV-4)相关病原学致病机理(尤其是协同致病机理)研究。当前，国内外尚未见仅需一组引物就可对感染禽类的腺病毒科禽腺病毒属的两种4型腺病毒(FAdV-4和DAdV-4)进行鉴别的实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容