[发明专利]一种利用双菌共培养体系生产3,4-二羟基丁酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用双菌共培养体系生产3,4‑二羟基丁酸的方法，是(1)构建氧化葡萄糖酸杆菌与工程大肠杆菌Escherichia coli 6KI的双菌共培养体系，(2)利用双菌共培养体系发酵生产3,4‑二羟基丁酸。实验证实，本发明提供的方法能够使3,4‑二羟基丁酸生产量达到3.26g/L，得率为0.47g 3,4‑二羟基丁酸/1g木糖，有效解决了目前报道的单一基因工程菌生产3,4‑二羟基丁酸所具有的有产量低问题，得率低的问题，并为氧化葡萄糖酸杆菌在生物法生产需要复杂合成途径的化学品的应用提供新思路，新方法。

技术领域

本发明涉及一种发酵生产3,4-二羟基丁酸的方法，尤其涉及一种利用氧化葡萄糖酸杆菌和工程大肠杆菌组成的共培养体系以木糖为底物发酵生产3,4-二羟基丁酸方法，属于生物技术领域。

背景技术

3,4-二羟基丁酸及其脱水产物3-羟基丁内酯均是重要的平台化合物(Gao H etal.,2017,Bioresour.Technol.,245:794-800)，广泛用于聚合物、溶剂和营养添加剂的生产(Wang J et al.,2017,Metab.Eng.,41:39-45)。化学法生产3,4-二羟基丁酸与3-羟基丁内酯具有反应条件苛刻、剧烈，底物昂贵，需要重金属或者稀有金属参与反应的缺点(KumarP et al.,2005,Tetrahedron:Asymmetry,16:2717-2721)。由于微生物发酵法生产化学品具有反应条件温和，污染少，底物廉价等优势，因此采用微生物发酵法生产3,4-二羟基丁酸具有重要研究价值和广阔市场前景。

大肠杆菌具有培养要求简单、生长迅速，遗传背景清晰，易于基因工程操作等特点，已成功用于代谢工程改造生产3,4-二羟基丁酸。由于存在中间产物具有毒害作用、高氧化还原压力、反应过程可逆等问题，用重组大肠杆菌生产3,4-二羟基丁酸得率低，产量低。据报道国内课题组在大肠杆菌中通过表达外源木糖脱氢酶、醛脱氢酶等代谢工程改造，以木糖为底物，实现了3,4-二羟基丁酸的生产，产量为0.38g/L(Gao H et al.,2017,Bioresour.Technol.,245:794-800)；国外有采用葡萄糖和乙醇酸为底物生产3,4-二羟基丁酸的报道，通过对大肠杆菌乙醛酸循环的代谢工程改造，3,4-二羟基丁酸产量达到0.7g/L(Dhamankar H et al.,2014,Metab.Eng.,25:72-81)。

氧化葡萄糖酸杆菌是一种严格好氧菌(Prust C et al.,2005,Nat.Biotechnol.,23:195-200)，其细胞膜具有多种膜结合脱氢酶，可以参与多种氧化反应，使其成为重要的工业应用菌株(Kiefler I et al.,2017,Appl.Microbiol.Biotechnol.,101:5453-5467)。例如，氧化葡萄糖酸杆菌在工业上广泛用于分别从葡萄糖、木糖、山梨醇和甘油生产葡萄糖酸、木糖酸、山梨糖和二羟基丙酮。然而，氧化葡萄糖酸杆菌存在直接将氧化产物分泌到胞外，体内TCA循环不完整，难以对其代谢工程改造等缺陷(Prust C et al.,2005,Nat.Biotechnol.,23:195-200；T et al.,2006,J.Bacteriol.,188:7668-7676)，限制了氧化葡萄糖酸杆菌在需要复杂代谢途径的化学品合成方面的应用。

经检索，有关利用大肠杆菌易于工程改造并结合氧化葡萄糖酸杆菌的不完全氧化能力及将氧化产物直接分泌到胞外的特点，建立一种氧化葡萄糖酸杆菌与工程大肠杆菌共培养体系，以木糖为底物发酵生产3,4-二羟基丁酸方法还未见报道。

发明内容

针对现有利用重组大肠杆菌生产3,4-二羟基丁酸的方法中，产品产量低、得率低，中间产物对于菌株具有毒害作用，反应过程可逆等问题。本发明提供了一种利用氧化葡萄糖酸杆菌和大肠杆菌组成的双菌共培养体系以木糖为底物高产3,4-二羟基丁酸的方法。

本发明所述的利用双菌共培养体系生产3,4-二羟基丁酸的方法，步骤是：

(1)构建氧化葡萄糖酸杆菌与工程大肠杆菌的双菌共培养体系