[发明专利]一种用于肠道病毒EV-A和EV-B的分型和/或检测的引物组合物

说明书

本发明公开了一种用于肠道病毒EV‑A和EV‑B的分型和/或检测的引物组合物，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示引物对1，和核苷酸序列如SEQ ID No.3～4所示引物对2。本发明所述的两对肠道病毒特异性引物位于肠道病毒的VP1基因相对保守区域，可在同一管检测反应体系中实现肠道病毒EV‑A和EV‑B的所有血清型的分型鉴定。本发明所述的测序方法简单，应用方便，扩增重复性好。

技术领域

本发明涉及肠道病毒技术领域，具体地，涉及一种用于肠道病毒EV-A和EV-B的分型和/或检测的引物组合物。

背景技术

肠道病毒(enterovirus,EV)是一类生物学性状相似、无包膜的单正链小RNA病毒。2016年，国际病毒命名委员会(ICTV)将小RNA病毒科分为35个病毒属，其中肠道病毒属下有7个病毒型可以感染人类，即肠道病毒EV-A、EV-B、EV-C、和EV-D，和鼻病毒RV-A、RV-B、和RV-C。人肠道病毒是指仅仅感染人类的肠道病毒EV-A、EV-B、EV-C、和EV-D。

人肠道病毒，主要经粪—口途径传播，病毒主要通过口腔或呼吸道上皮表面进入体内，在肠道中增殖，然后通过血液传播，引起多种肠道外感染性疾病，如新生儿败血症样疾病，脑炎，急性弛缓性麻痹，手足口病，疱疹性咽炎，胸膜痛，心包炎和心肌炎。

其中致病以手足口病为主，多发生于5岁以下婴幼儿，可引起严重的中枢神经系统损伤和心肺衰竭等症状，2008年5月，手足口病被纳入我国法定报告的丙类传染病。近年来，手足口病引起的病例呈高发态势，严重危害婴幼儿健康和生命安全，给家庭带来沉重的疾病和经济负担。而目前我国对手足口病的监测的病毒主要集中在属于EV-A型的：在肠道病毒A组71型(enterovirus A71，EV A71)、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16，CVA16)、柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10，CVA10)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6，CVA6)。对其他肠道病毒的分型鉴定尚不多，但近年来其他肠道病毒比例有所升高。

此外，引起手足口病的病原谱构成呈多样化和复杂化，病毒分布在世界各地,热带及亚热带地区终年流行，感染高峰出现在夏季和秋季，在美国每年造成1000万到1500万有症状的感染，给我们的社会和医疗系统造成了巨大的负担。

自2008年起开展的手足口病常规监测中仅针对EV-A71和CV-A16进行分型鉴定，对非EV-A71非CV-A16的其他肠道病毒则未进行进一步的分型鉴定，而目前已报道的肠道病毒的检测技术主要为两类：一个是传统的生物学方法，如细胞培养法，该方法成本高、费时、操作繁琐、易污染，作为病毒体的筛查手段并不理想；另一个是以PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势。但是现有的PCR及其衍生技术，通常为采用特定病毒种类的引物，易导致手足口病病原体检测不明确或漏检。近年来，也有报道用通用引物来检测肠道病毒，其采用的引物设计区域为5’端非编码区域，该区域高度保守无法用于病毒分型。因此为了更好的对肠道病毒进行检测及型别分析，需要开发一种能够检测特定病毒属所有病毒种类进行鉴定和检测的方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种分型和或检测肠道病毒EV-A和EV-B的引物组合物，本发明提供了这种发展的可能，不仅可以为今后的手足口病流行病学分析、致病机理等打下基础，也能为临床和科学研究提供新检测病毒感染的思路。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

提取病患标本样品中的病原体核酸RNA；利用随机六聚体引物进行RT-PCR核酸扩增反应，将病原体核酸RNA逆转为cDNA；将上述cDNA作为模板，加入核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示的引物SO224和SO222引物进行第一次PCR扩增反应；用第一次PCR扩增反应所得产物作为第二次PCR反应的模板，加入核苷酸序列如SEQ ID No.3～4所示的引物AN89和AN88再进行第二次PCR反应。